식품의약품안전처 공고 제2017-306호

건강기능식품의 기준 및 규격

일부개정고시(안) 행정예고

2017.8.24.

식품의약품안전처

식품의약품안전처 공고 제2017-306호

「건강기능식품의 기준 및 규격」(식품의약품안전처고시 제2016-143호, 2016.12.21.)을 일부 개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이  공고합니다.

2017년 8월 24일

식품의약품안전처장

「건강기능식품의 기준 및 규격」일부 개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유

영양소 원료 확대를 위해 식품 및 식품첨가물로 규격이 설정되지 않은 원료에 대한 규격 적용 방안을 신설함

영양성분 기준치 개정에 따라 비타민 D와 크롬의 일일섭취량을 개정하고, 엽산과 철의 원료를 추가하며, 타 고시 등과 용어를 통일하여 일관성을 제고하고자 함

감마리놀렌산 함유 유지의 섭취 시 주의사항 적용을 명확하게 하고,    ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣의 시험법을 효율적으로 개정하여 영업자 및 관계공무원의 이해를 도모하고자 함

2. 주요 내용

가. 식품 및 식품첨가물로 규격이 설정되지 않은 원료의 규격 적용

1) 영양소 원료 중 식품 및 식품첨가물로 규격이 정하여지지 않는 경우 주요 외국의 규격을 적용할 수 있도록 개정

나. 영양소의 일일섭취량 개정

1) ‘15년 11월 한국인 영양소 섭취기준 개정에 따라 영양소 기준치 현행화

2) 비타민 D, 크롬의 최소함량기준 개정

3) [별표 2] 영양소 기준치 및 [별표 3] 한국인 영양섭취기준 현행화

4) ‘영양소’를 ‘영양성분’으로 용어 통일하여 타 고시 등과 일관성 제고

다. 영양소의 원료 추가

1) 엽산의 원료로 메틸테트라히드로엽산글루코사민((6S)-5-Methyltetrahydrofolic acid, Glucosaming Salt)) 추가

2) 철의 원료로 구연산제일철나트륨(Sodium ferrous citrate) 추가

라. 감마리놀렌산 함유 유지의 섭취 시 주의사항 적용

1) 감마리놀렌산 함유 유지의 기능성 중 면역과민반응에 의한 피부상태 개선에 도움을 줄 수 있음에 한하여 섭취 시 주의사항 적용

마. 시험법 개정

1) 비타민 E, 요오드, 베타글루칸, 계피산, 카테킨, 총 플라보노이드, 대두이소플라본, 총 폴리페놀, 깅콜릭산, 히알루론산, 알파에스1카제인,  글루코실세라미드의 시험법 개선

3. 의견 제출

「건강기능식품의 기준 및 규격」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이   있는 단체 또는 개인은 2017년 10월 23일까지 다음 사항을 기재한 의견서를   식품의약품안전처장(우편번호 : 363-700, 주소 : 충청북도 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명2로 187 오송보건의료행정타운 식품의약품안전처, 참조 : 식품기준과, (전화) 043-719-2439, (팩스) 043-719-2400 에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 항목별 의견(찬․반 여부와 그 이유)

나. 성명(단체의 경우 단체명과 그 대표자의 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2017-000호

｢건강기능식품에 관한 법률｣ 제14조 및 제15조에 따른 ｢건강기능식품의 기준 및 규격｣(식품의약품안전처 고시 제2016-143호, 2016.12.21.)을 다음과   같이 개정 고시합니다.

2017년  월   일

식품의약품안전처장

건강기능식품의 기준 및 규격 일부개정고시(안)

건강기능식품의 기준 및 규격 일부를 다음과 같이 개정한다.

제 1, 3, 2), (1) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 2, 1, 2)의 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 2, 1, 3), (2), (라) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 2, 2, 4) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 2, 2, 5), (2) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 2, 3, 5) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 하고, “영양소기준치”를 “영양성분기준치”로 한다.

제 2, 3, [표1]의 2 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제3, 1. “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 3, 1, 3) 중 “영양소기준치의”를 “영양성분기준치의”로 한다.

제 3, 1, 5) 중 “영양소기준치의”를 “영양성분기준치의”로 하고,  “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 3, 1 중 “7) 6)의 규정에도 불구하고, 이 공전에서 정하는 원료의 목록에는 제시되어 있으나 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격에서 기준과 규격이 정하여지지 않은 원료에 대하여는 식품의약품안전처장은 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC) 규정 등  주요 선진외국의 기준 및 규격을 적용할 수 있다.”를 신설한다.

제 3, 1-3, 3) (2)를 다음과 같이 한다.

(2) 일일섭취량 : 3 ～ 10 ug

제 3, 1-11, 1) (1) 중 “(나) 식품원료를 사용하여 엽산을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것”을 “(나) 메틸테트라히드로엽산글루코사민((6S)-5-Methyltetrahydrofolic acid, Glucosaming Salt))”으로 하고, (다)를 다음과 같이 신설한다.

(다) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

제 3, 1-17, 1) (1) 중 “(파) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것”을 “(파) 구연산제일철나트륨(Sodium ferrous citrate)”으로 하고, (하)를 다음과 같이 신설한다.

(하) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

제 3, 1-25, 3) (1)을 다음과 같이 한다.

(1) 일일섭취량 : 0.009 ～ 9 mg

제 3, 1-26, 3) (1) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 3, 1-27, 3) (1) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 3, 1-28, 3) (1) 중 “영양소”를 “영양성분”으로 한다.

제 3, “[별표 2] 영양소 기준치”를 “[별표 2] 1일 영양성분 기준치”로 하고 다음과 같이 한다.

영양성분	기준치	영양성분	기준치	영양성분	기준치
탄수화물(g)	324	크롬(㎍)	30	몰리브덴(㎍)	25
당류(g)	100	칼슘(㎎)	700	비타민B12(㎍)	2.4
식이섬유(g)	25	철분(㎎)	12	비오틴(㎍)	30
단백질(g)	55	비타민D(㎍)	10	판토텐산(㎎)	5
지방(g)	54	비타민E(㎎α-TE)	11	인(㎎)	700
포화지방(g)	15	비타민K(㎍)	70	요오드(㎍)	150
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B1(㎎)	1.2	마그네슘(㎎)	315
나트륨(㎎)	2,000	비타민B2(㎎)	1.4	아연(㎎)	8.5
칼륨(㎎)	3,500	나이아신(㎎ NE)	15	셀렌(㎍)	55
비타민A(㎍ RE)	700	비타민B6(㎎)	1.5	구리(㎎)	0.8
비타민C(㎎)	100	엽산(㎍)	400	망간(㎎)	3.0

제 3, “[별표 3]”을 다음과 같이 한다.

[별표 3] 한국인 영양섭취기준

연 령	탄수화물 (g)		지방 (g)		n-6계 지방산 (g)		n-3계 지방산 (g)		단백질 (g)		수분(mL)		식이섬유 (g)			비타민A (μg RE)			비타민D (μg)		비타민E (mg α-TE)		비타민K (μg)		비타민C (mg)		티아민 (mg)		리보플라민 (mg)		니아신 (mg NE)		비타민B6 (mg)		엽산 (μg DFE)		비타민B12 (㎍)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량 (총수분)		권장 섭취량	충분 섭취량		권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		60 90		25 25		2.0 4.5		0.3 0.8	15	9.5		700 800						350 450		5 5		3 4		4 7		35 45		0.2 0.3		0.3 0.4		2 3		0.1 0.3		65 80		0.3 0.5
유아 1～2(세) 3～5									15 20			1,100 1,500			10 15		300 350			5 5		5 6		25 30	35 40		0.5 0.5		0.5 0.6		6 7		0.6 0.7		150 180		0.9 1.1
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상									30 40 55 65 65 60 60 55 55			1,800 2,100 2,300 2,600 2,600 2,500 2,200 2,100 2,100			20 20 25 25 25 25 25 25 25		450 600 750 850 800 750 750 700 700			5 5 10 10 10 10 10 15 15		7 9 10 11 12 12 12 12 12		45 55 70 80 75 75 75 75 75	55 70 90 105 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		0.9 1.2 1.5 1.7 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		9 12 15 17 16 16 16 16 16		0.9 1.1 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.7 2.3 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상									25 40 50 50 55 50 50 45 45			1,700 1,900 2,000 2,000 2,100 2,000 1,900 1,800 1,800			20 20 20 20 20 20 20 20 20		400 550 650 600 650 650 600 550 550			5 5 10 10 10 10 10 15 15		7 9 10 11 12 12 12 12 12		45 55 65 65 65 65 65 65 65	60 80 100 95 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.2 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1		0.8 1.0 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		9 12 15 14 14 14 14 14 14		0.9 1.1 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.7 2.3 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
임신부									+15/+30			+200			+5		+70			+0		+0		+0	+10		+0.4		+0.4		+4		+0.8		+220		+0.2
수유부									+25			+700			+5		+490			+0		+3		+0	+40		+0.4		+0.5		+3		+0.8		+150		+0.4

〔사단법인〕 보건복지부, 한국영양학회 : 한국인 영양소 섭취기준 (2015)

연 령	판토텐산 (mg)		비오틴 (μg)		칼슘 (mg)		인 (mg)		나트륨 (g)		염소 (g)		칼륨 (g)		마그네슘 (mg)		철 (mg)		아연 (mg)		구리 (μg)		불소 (mg)		망간 (mg)		요오드 (μg)		셀레늄 (μg)		몰리브덴 (μg)		크롬 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		1.7 1.9		5 7		210 300		100 300		0.12 0.37		0.18 0.56		0.4 0.7		30 55	6	0.3	3	2		240 310		0.01 0.5		0.01 0.8		130 170		9 11				0.2 5.0
유아 1～2(세) 3～5		2 2		9 11	500 600		450 550			0.9 1.0		1.3 1.5		2.0 2.3	80 100		6 6		3 4		280 320			0.6 0.8		1.5 2.0	80 90		23 25					12 12
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상		3 4 5 5 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30	700 800 1,000 900 800 800 750 700 700		600 1,200 1,200 1,200 700 700 700 700 700			1.2 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.1		1.9 2.1 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.7		2.6 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	160 230 320 400 350 370 370 370 370		9 10 14 14 10 10 10 9 9		6 8 8 10 10 10 9 9 9		440 580 740 840 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 3.0 3.0 3.0 3.0		2.5 3.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0	100 110 130 130 150 150 150 150 150		35 45 60 65 60 60 60 60 60		30 25 25 25 25			20 25 35 40 35 35 35 35 35
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상		3 4 5 5 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30	700 800 900 800 700 700 800 800 800		550 1,200 1,200 1,200 700 700 700 700 700			1.2 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.1		1.9 2.1 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.7		2.6 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	150 210 290 340 280 280 280 280 280		8 10 16 14 14 14 8 8 7		5 8 8 9 8 8 7 7 7		440 580 740 840 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5		2.5 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	100 110 130 130 150 150 150 150 150		35 45 60 65 60 60 60 60 60		25 25 25 25 25			15 20 25 25 25 25 25 25 25
임신부		+1		+0	+0		+0			+1.5		+2.3		+0	+40		+10		+2.5		+130			+0		+0	+90		+4					+5
수유부		+2		+5	+0		+0			+1.5		+2.3		+0.4	+0		+0		+5.0		+480			+0		+0	+190		+10					+20

* 권장섭취량 : 1일 연령별로 권장되는 영양소 섭취량으로서 평균 필요량을 근거로 하여 산출

* 충분섭취량 : 권장섭취량을 산출할 수 없는 경우 역학조사 결과를 토대로 건강인의 영양소 섭취수준을 기준으로 산출

* 임신부 단백질 권장섭취량: 임신 2, 3분기별 부가량

제 3, 2, 2-17, 3) (3)을 다음과 같이 한다.

(3) 섭취 시 주의사항

영·유아·어린이는 섭취 전 의사와 상담한 후 섭취할 것

(면역과민반응에 의한 피부상태 개선에 도움을 줄 수 있음에 한함)

제 4, 3, 3-4, 3-4-1, 5, 5.1, 5.1.1 중 “베타카로틴”을 “토코페롤”으로 한다.

제 4, 3, 3-17, “3-17 요오드”를 “3-17 3-17-1 요오드(제1법)”으로 하고, “3-17-2 요오드(제2법)”을 다음과 같이 신설한다.

3-17-2 요오드(제 2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중에 존재하는 요오드를 마이크로웨이브 분해 장치에 넣고 테트라메틸암모늄하이드록사이드(TMAH)용액으로 분해하여 유도결합플라즈마/질량분석기로 정량하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 50 mL용 폴리프로필렌 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 유도결합플라즈마/질량분석기

2.2.2 마이크로웨이브 분해 장치

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 요오드화칼륨(Potassium iodide)

분자식 : KI, 분자량 : 166.0, CAS No. : 7681-11-0

3.2 일반시약
3.2.1 25% 테트라메틸암모늄하이드록사이드(Tetramethylammonium              hydroxide, TMAH)
3.2.2 증류수

4. 시험과정

4.1 시약조제

4.1.1 5% TMAH: 25% TMAH 100 mL을 취하여 증류수로 500 mL로 한다.

4.2 표준용액 조제

4.2.1 내부 표준용액: 시판 Te 표준용액(1,000 μg/mL) 1 mL를 취하여 증류수로 500 mL로 한다(Te 2 μg/mL 함유).

4.2.2 요오드 표준용액: 요오드화칼륨 0.1308 g을 취하고 증류수를 가하여 100 mL(1,000 μg/mL)로 한다. 다시 증류수로 희석하여 1 μg/mL으로 한다. 이 용액 일정량을 취하여 각각 50 mL 용 폴리프로필렌 부피 플라스크에 넣고 0.5% TMAH 용액으로 정용한다. 이들 용액 10 mL에 내부표준용액 100 μL를 가한 것을 표준용액으로 한다.

4.3 시험용액 조제

4.3.1 균질화된 시료 약 0.5 g을 마이크로웨이브 분해장치에 넣고 5% TMAH 용액을 적절히 가하여 90℃, 1시간동안 분해한다.

4.3.2 분해액을 방냉시킨 후 50 mL 용 폴리프로필렌 부피플라스크에 넣고 증류수를 가하여 정용한다.

4.3.3 검량선 범위에 들어가게 0.5% TMAH로 적절히 희석한다.

4.3.4 이 액 10 mL를 취하여 내부표준용액 100 μL를 가한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표. ICP-MS 측정 조건(예)

항목	조건
기기	ICP-MS
시료 도입 유속	1.0 mL/min
RF 파워	1.1 kw
플라즈마 기체	아르곤(15 L/min)
이동상 기체	아르곤(0.7 L/min)
메이크업 기체	아르곤(0.29 L/min)
m/z	요오드(I) 127 내부표준물질(Te): 128
세척용매	0.5% TMAH

5.2 계산

5.2.1 요오드 함량(ng/g) = C × (a × b)/S

C : 검량선에서 구한 시험용액 중 요오드 농도(ng/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

제 4, 3, 3-25, “3-25 베타글루칸”을 “3-25 베타글루칸 3-25-1 베타글루칸(제1법 영지버섯자실체추출물)”로 하고, 다음과 같이 한다.

3-25 베타글루칸

3-25-1 베타글루칸(제 1법 영지버섯자실체추출물)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료를 효소처리하여 베타글루칸만을 침전 시킨 후 글루코오스 형태로 분해하고 발색시켜 분광광도계로 정량하는 방법으로 영지버섯자실체추출물에 적용하며 최대흡수파장인 470 nm에서 분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 삼각플라스크

2.1.2 pH 측정기

2.1.3 항온 진탕기

2.1.4 원심분리기

2.1.5 부피플라스크(50 mL)

2.2 분석장비

2.2.1 분광광도계

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루코오스(D-(+)-glucose)
분자식 : C6H12O6, 분자량 : 180.16, CAS No. : 50-99-7

3.2 일반시약

3.2.1 에탄올(Ethanol)

3.2.2  α-아밀라아제(α-amylase, Sigma A3306 또는 Termamyl 300L, Novo    361-6282)

3.2.3 셀룰라아제(Cellulase, Sigma C8546)

3.2.4 프로테아제(Protease, Sigma P3910)

3.2.5 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase, Sigma A9913)

3.2.6 0.1 N 염산(Hydrochloric acid)

3.2.7 황산(Sulfuric acid)

3.2.8 페놀(Phenol)

3.2.9 0.1 N 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.3 시액의 조제

3.3.1 5% 페놀용액

페놀 5 g을 취하여 증류수를 가해 100 mL로 한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 D-글루코오스 표준물질 0.1 g을 100 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 증류수를 가하여 완전히 녹이고 100 mL로 한 후 희석하여 표준원액으로 한다.

4.1.3 위의 용액을 증류수로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제(전처리 과정)

4.2.1 베타글루칸으로서 100 mg의 시료를 삼각플라스크에 취한다(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올 용액을 이용하여 베타글루칸 20 mg당 10 mL씩으로 세척한다).

4.2.2 증류수 10 mL를 가한다.

4.2.3 여기에 아밀라아제(20,000∼60,000 U/mL) 0.1 mL을 가한다.

4.2.4 0.1 N 수산화나트륨용액을 이용하여 pH 6.9로 한 후 20℃ 항온수조에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다.

4.2.5 위의 용액에 0.1 N 염산용액으로 pH 5.0으로 맞추고 셀룰라아제(1,600 U/mL)를 0.1 mL 넣고 37℃ 항온수조에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다.

4.2.6 위의 용액에 프로테아제(600∼1,300 U/mL) 약 0.1 mL을 넣고 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH 7.5로 한 후 37℃ 항온수조에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다.

4.2.7 위의 용액에 아밀로글루코시다제(10,000 U/mL) 약 0.1 mL을 넣고 0.1 N 염산용액으로 pH 4.8로 한 후 60℃ 항온수조에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다.

4.2.8 효소분해물[4.2.7]에 95% 에탄올 40 mL를 가하여 4℃에서 12시간 이상 침전 시킨다.

4.2.9 위의 용액을 원심분리(3,000 × G, 20분)하여 시료의 침전물을 취한다.

4.2.10 시료의 침전물[4.2.9]에 80% 에탄올 50 mL를 가하여 4℃에서 1시간동안 침전시킨다.

4.2.11 위의 용액을 원심분리(3,000 × G, 20분) 한다.

4.2.12 원심분리된 침전물[4.2.11]에 증류수 10 mL를 가한 후 침전물을 혼합하여 균질화시킨다.

4.2.13 위의 용액을 증류수로 50 mL가 되도록 한 후, 이를 적정농도가 되도록 희석하여 시험용액으로 한다.

4.3 시험용액의 조제(발색 과정)

4.3.1 15 mL 시험관에 농도별 표준용액과 시험용액(공시험포함)으로 구분하여 각각 5% 페놀용액 1 mL를 넣는다.

4.3.2 위의 시험관에 농도별 표준용액[4.1]을 각각 1 mL씩 가하고, 시험용액은 시험용액[4.2] 0.1 mL과 증류수 0.9 mL를 가한다. 공시험은 증류수 1 mL을 가한다. 이 용액들을 10초간 잘 흔들어 섞는다.

4.3.3 위의 시험관에 각각 황산 5 mL을 가하여 혼합한다.

4.3.4 실온에서 20분간 반응시킨다.

5. 분석 및 계산

5.1 흡광도 측정

5.1.1 파장 470 nm에서 흡광도를 측정한다.

5.2 계산

5.2.1 베타글루칸함량(mg/g) = C × (a × b)/S × 10 × 1/1,000 × 0.9

C: 시험용액중의 글루코오스 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 희석배수

S: 시료 채취량(g)

10: 발색과정의 희석배수

1/1,000: 단위 환산 계수

0.9: 베타글루칸 전환계수(162/180)

3-25-2 베타글루칸(제2법 상황버섯추출물)을 다음과 같이 신설한다.

3-25-2 베타글루칸(제2법 상황버섯추출물)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료에 있는 총 글루칸에서 베타글루칸 외의 글루칸 함량을 제거하여 베타글루칸의 값을 구한다. 산분해와 효소처리를 하여 글루코오스 형태로 분해한 후 발색시켜 분광광도계로 정량하는 방법으로 상황버섯추출물에 적용하며 최대흡수파장인 470 nm에서 분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 분석저울

2.1.2 항온수조

2.1.3 pH 미터

2.1.4 부피플라스크(100 mL)

2.1.5 마개 있는 50 mL 유리시험관, 5 mL 시험관

2.1.6 원심분리기

2.1.7 교반기

2.1.8 유리섬유여과지(Whatman GF/A 유리섬유 필터 또는 이와 동등한 것)

2.2 분석장비

2.2.1 분광광도계

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루코오스(D-(+)-glucose)

분자식 : C6H12O6, 분자량 : 180.16, CAS No. : 50-99-7

3.2 일반시약

3.2.1 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.2 초산(Acetic acid)

3.2.3 진한염산(Hydrochloric acid, 37%(v/v))

3.2.4 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.5 버섯효모베타글루칸 분석키트(Mushroom and Yeast Beta-glucan assay procedure Kit, Megazyme, K-YBGL, Ireland)

[키트의 구성]

Bottle 1 : 1,3-베타글루카나아제(1,000 U/mL), 베타글루코시다아제(20 U/mL)혼합액

Bottle 2 : Amyloglucosidase(1,630 U/mL), Invertase(500 U/mL), 50% 글리세린 혼합액

Bottle 3 : 포도당 반응 완충액

Bottle 4 : 포도당 측정 반응액(글루코오스 옥시다아제 12,000 U/L 이상, 페록시다아제 650 U/L 이상, 4-아미노안티피린 0.4 mM)

3.2.6 증류수

3.3 시액의 조제

3.3.1 4 M 수산화나트륨용액

수산화나트륨 80.0 g을 증류수로 용해하여 500 mL로 정용한다.

3.3.2 200 mM 초산완충액(Acetate buffer, pH 5.0)

초산 11.6 mL를 900 mL 증류수에 용해한 후 4 M 수산화나트륨용액으로 pH를 5.0으로 맞추어 1 L로 정용한다.

3.3.3 1.2 M 초산완충액(Acetate buffer, pH 3.8)

초산 69.6 mL를 800 mL 증류수에 용해한 후 4 M 수산화나트륨용액으로 pH를 3.8로 맞추어 1 L로 정용한다.

3.3.4 2 M 수산화칼륨용액

수산화칼륨 112 g을 증류수로 용해하여 1 L로 정용한다.

3.3.5 베타글루칸 효소혼합액

K-YBGL의 Bottle 1에 200 mM 초산완충액(pH 5.0) 8 mL을 첨가한다. 1 mL 씩 나누어 –20℃에서 보관한다.

3.3.6 알파글루칸 효소혼합액

K-YBGL에 들어있는 Bottle 2를 그대로 사용한다.

3.3.7 발색시약 (GOPOD)

K-YBGL에 들어있는 Bottle 3 전량을 1L 부피플라스크에 넣은 후 증류수로 희석하고 1 L로 정용한다. 이 용액 소량으로 Bottle 4 전량을 녹이고 다시 Bottle 3가 녹아있는 이전 1L 부피플라스크에 넣어 충분히 섞은 후 사용한다. 40 mL 씩 나누어 –20℃에서 보관한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액의 제조

4.1.1 D-글루코오스 표준물질 500 mg을 50 mL 부피플라스크에 넣는다

4.1.2 증류수를 가하여 완전히 녹인 후 표선까지 정용하여 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 증류수로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 총 글루칸 측정

4.2.1.1 시료는 0.5 mm의 체를 통과할 수 있도록 분쇄한다

4.2.1.2 마개가 있는 50 mL 유리시험관에 베타글루칸으로서 10 mg에 해당하는 시료를 칭량한다.

4.2.1.3 진한 염산을 각 시험관에 1.5 mL씩 가한 후 덩어리가 생기지 않도록 강하게 교반한 후 40℃ 항온수조에서 45분간 반응시킨다.

4.2.1.4 각 시험관에 증류수 10 mL를 첨가하고 강하게 교반한다.

4.2.1.5 시험관 뚜껑을 완전히 닫지 않은 상태로 100℃ 항온수조에서 5분간 방치한 후 뚜껑을 완전히 닫아 2시간 반응시킨다.

4.2.1.6 반응 후 실온까지 냉각하여 2 M 수산화칼륨용액을 10 mL 가한다.

4.2.1.7 200 mM 초산완충액으로 시험관의 잔여물을 남기지 않고 100 mL 부피플라스크로 옮긴 후 표선까지 정용한다.

4.2.1.8 유리섬유여과지(Whatman GF/A)를 이용하여 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.1.9 시험용액 0.1 mL을 새로운 5 mL 시험관에 옮긴 후 베타글루칸 효소혼합액 0.1 mL을 각 시험관에 가하여 40℃에서 30분간 반응시킨다(총 글루칸 측정 효소공시험 시험관에 200 mM 초산완충액 0.1 mL와 베타글루칸 효소혼합액 0.1 mL첨가하고, 발색시약 공시험 시험관에 200 mM 초산완충액 0.2 mL를 가한 후 다음단계 부터 함께 반응시킨다).

4.2.1.10 반응 후 발색시약(GOPOD) 3 mL을 가하여 실온에서 10분간 반응시킨다.

4.2.1.11 증류수를 대조액으로 분광광도계 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.2.2 베타글루칸을 제외한 글루칸 측정

4.2.2.1 시험관에 베타글루칸으로서 10 mg에 해당하는 시료를 칭량한다(효소공시험을 동시에 진행한다).

4.2.2.2 2 M 수산화칼륨용액을 각 시험관에 2 mL씩 가한 후 덩어리가 생기지 않도록 강하게 교반한다(덩어리가 생겨 제거되지 않을 경우 실온에 20분간 방치한 후 강하게 교반한다).

4.2.2.3 1.2 M 초산완충액 8 mL을 가하여 강하게 교반한 후 알파글루칸 효소혼합액 0.2 mL을 가하여 40℃ 항온수조에서 30분간 반응시킨다.

4.2.2.4 반응액을 원심분리(1,500 × G, 10분)하여 시험용액으로 한다.

4.2.2.5 시험용액 0.1 mL을 새로운 시험관에 옮긴 후 발색시약(GOPOD) 3 mL을 각 시험관에 가하여 실온에서 10분간 반응시킨다.

4.2.2.6 증류수를 대조액으로 분광광도계 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 분석 및 계산

5.1 흡광도 측정

5.1.1 증류수를 대조액으로 하여 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

5.2 계산

5.2.1 농도별 표준용액의 흡광도에서 발색시약 공시험 흡광도를 뺀 값을 검량선 작성에 이용한다.

5.2.3.2 총 글루칸 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × 0.9

5.2.3.3 베타글루칸을 제외한 글루칸의 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × 0.9

5.2.3.4 베타글루칸 함량(mg/g)

= 총 글루칸 함량(mg/g) - 베타글루칸을 제외한 글루칸의 함량(mg/g)

C :  시험용액의 농도(μg/mL)

a： 시험용액의 전량(mL)

b： 희석 배수

S： 시료중량（mg）

0.9： 베타글루칸 전환계수(162/180)

제 4, 3, 3-47, 1 중 “280 nm”를 “275 nm”로 한다.

제 4, 3, 3-47, 2. 2.2.4 “옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것”을 “YMC-triart C18(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 컬럼 또는 이와 동등한 것”로 한다.

제 4, 3, 3-47, 2. 2.3을 삭제한다.

제 4, 3, 3-47, 4, 4.1, 4.1.1 중 “4가지 표준물질 10 mg을 각각 10 mL”를 “표준물질(EGC, EGCG, EC, ECG) 각각 50 mg씩  50 mL ”로 한다.

제 4, 3, 3-47, 4, 4.1, 4.1.3 “적당량 희석하여 검량선 작성에 사용한다.”를 “50% 메탄올로 적당량 희석하여 표준용액으로 사용한다(표준용액은 사용 시 조제한다).”로 한다.

제 4, 3, 3-47, 4, 4.2, 4.2.1 중 “합계로서”를 “합으로서”로 하고, “메탄올을 가하여”를 “50% 메탄올을 가한 후 20분간”으로 하며, 후단에 “필요한 경우 원심분리한다”를 신설한다.

제 4, 3, 3-47, 4, 4.2, 4.2.2 중 “메탄올을”을 “실온까지 식힌 후 50% 메탄올을”로 하고, 후단에 “되도록 시험용액은 조제 후 즉시 기기분석한다”를 신설한다.

제 4, 3, 3-47, 5, 5.1, 표1.과 표2를 다음과 같이 한다.

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
주입량	10 μL
검출기 파장	275 nm
칼럼 온도	35℃
이동상	A 용액 - 0.1% 인산용액 B 용액 - 0.1% 초산이 함유된 아세토니트릴
유속	1.0 mL/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	A 용액(%)	B 용액(%)
0	90	10
2	90	10
3	85	15
10	80	20
12	10	90
16	10	90
17	90	10
20	90	10

제 4, 3, 3-49, 4, 4.3, 4.3.1 중 “대조액과 시험액용으로”를 “공시험용과 시험용으로”로 한다.

제 4, 3, 3-49, 5, 5.1, “5.1 결과 분석(예)”를 “5.1 결과 분석”으로 하고, 5.1.2 중 “적용시킨다”를 “적용시켜 시료 중 총 플라보노이드의 함량을 구한다”로 한다.

제 4, 3, 3-50, 3-50-3을 다음과 같이 신설한다.

3-50-3 계피산(Cinnamic acid) 확인(제2법)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료 중 계피산을 20% 아세토니트릴에 용해한 후 초음파 추출하고, 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정성 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피 플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제    octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 계피산(Cinnamic acid, trans-3-Phenylacrylic acid)

분자식 : C9H8O2, 분자량 : 148.16, CAS No. : 140-10-3

3.2 일반시약

3.2.1 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.2 개미산(Formic acid)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 계피산 10 mg을 정밀하게 50 mL 부피플라스크에 취한 후 20% 아세토니트릴을 가하여 정용한 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 20% 아세토니트릴로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.(10 ∼ 500 μg/L)

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 약 2 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 20% 아세토니트릴로 정용한다.

4.2.2 위의 용액을 30분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 20% 아세토니트릴로 적절히 희석한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A: 0.1 % 개미산용액 B: 0.1 % 개미산을 함유한 아세토니트릴
칼럼온도	40℃
유속	0.3 mL/분
주입량	2 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary voltage	3.0 kV
Cone voltage	26 V
Desolvation temperature	350℃
Monitor ions(m/z)	149(precursor ion), 103, 77(product ion)

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
0.1	80	20
3	5	95
4	5	95
4.1	80	20
6	80	20

5.2 정성확인

5.2.1 시험한 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)으로 계피산을 확인한다.

제 4, 3, 3-54, “3-54 대두이소플라본”을 “3-54 이소플라본”으로 하고, “3-54-1 대두이소플라본(제1법)”을 “3-54-1 이소플라본(제1법)”으로 하며, 다음과 같이 한다.

3-54 이소플라본

3-54-1 이소플라본(제1법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 80% 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하고 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(최대흡수파장 260 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 이소플라본 중 배당체 및 비배당체를 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(10 mL, 50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 다이드진(Daidzin)

분자식 : C21H20O9, 분자량 : 416.38, CAS No. : 552-66-9

3.1.2. 글리시틴(Glycitin)

분자식 : C22H22O10, 분자량 : 446.41, CAS No. : 40246-10-4

3.1.3. 제니스틴(Genistin)

분자식 : C21H20O10, 분자량 : 432.38, CAS No. : 529-59-9

3.1.4. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.5. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.6. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.3 초산(Acetic acid)

3.2.4 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

3.2.5 개미산(Formic acid)

4. 시험과정

4.1 표준용액 조제

4.1.1 각 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.4 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethylsulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.5 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다(표준용액 농도 범위 0.1～80 μg/mL).

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 분말형제품

4.2.1.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 80% 메탄올로 정용한다.

4.2.1.2 30분간 초음파 처리한다.

4.2.1.3 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.2 유지형제품

4.2.2.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2.2 클로로포름 2 mL을 넣어 충분히 분산시킨다.

4.2.2.3 80% 메탄올로 정용한 후 30분간 초음파 처리한다.

4.2.2.4 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목

조건

주입량

5 μL

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 초산용액

B: 0.1% 초산을 함유한 메탄올

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
15	50	50
25	30	70
30	80	20

검출기 파장

260 nm

유량

1.0 ml/분

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유량

0.3 ml/분

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 개미산용액

B: 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	95	5
5.0	5	95
5.5	95	5
6.0	95	5

이온화

ESI, positive

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

120℃

Desolvation Temp.

350℃

표 3. 질량분석기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)	Cone(V)
Daidzin	417	255	25
Glycitin	447	285	25
Genistin	433	271	30
Daidzein	255	199, 137	30
Glycitein	285	242, 270	50
Genistein	271	153, 149	25

5.2 계산

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)= C × (a×b)/S × 1/1,000

C  : 시험용액 중의 각 이소플라본(비배당체) 농도(μg/mL)

a  : 시험용액의 전량(mL)

b  : 희석배수

S  : 시료채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

* 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

제 4, 3, 3-54, 3-54-2을 다음과 같이 한다.

3-54-2 이소플라본(제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 염기성가수분해를 통해 시료에 존재하는 이소플라본 중 아세틸배당체, 말로닐배당체를 배당체로 전환시켜 함께 정량할 수 있는 방법으로, 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(최대흡수파장 260 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 정량분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(10 mL, 50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

이동상을 이용하여 용매를 분당 1.0 mL로 충분한 시간동안 흘려 안정화 시킨다.

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 다이드진(Daidzin)

분자식 : C21H20O9, 분자량 : 416.38, CAS No. : 552-66-9

3.1.2. 글리시틴(Glycitin)

분자식 : C22H22O10, 분자량 : 446.41, CAS No. : 40246-10-4

3.1.3. 제니스틴(Genistin)

분자식 : C21H20O10, 분자량 : 432.38, CAS No. : 529-59-9

3.1.4. 다이드제인(Daidzein)

분자식 : C15H10O4, 분자량 : 254.23, CAS No. : 486-66-8

3.1.5. 제니스테인(Genistein)

분자식 : C15H10O5, 분자량 : 270.24, CAS No. : 446-72-0

3.1.6. 글리시테인(Glycitein)

분자식 : C16H12O5, 분자량 : 284.26, CAS No. : 40957-83-3

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.3 초산(Acetic acid)

3.2.4 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

3.2.5 개미산(Formic acid)

3.2.6 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 각 이소플라본(Daidzin, Genistin, Glycitin, Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준물질 50 mg을 정밀히 측정한다.

4.1.2 정밀히 측정한 표준물질을 50 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.3 배당체(Daidzin, Genistin, Glycitin) 표준품은 메탄올을 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.4 비배당체(Daidzein, Genistein, Glycitein) 표준품은 Dimethyl sulfoxide를 가하여 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.5 위의 용액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다(표준용액 농도 범위 0.1～80 μg/mL).

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 분말형제품

4.2.1.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.1.2 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 30분간 초음파 추출한다.

4.2.1.3 2M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣고 상온에서 10분간 회전교반한다.

4.2.1.4 초산 1 mL를 넣고 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 정용한다.

4.2.1.5 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.2 유지형제품

4.2.2.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2.2 클로로포름 2 mL을 넣어 충분히 분산시킨다.

4.2.2.3 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 30분간 초음파 추출한다.

4.2.2.4 2M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣고 상온에서 10분간 회전교반한다.

4.2.2.5 초산 1 mL를 넣고 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 정용한다.

4.2.2.6 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목

조건

주입량

5 μL

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 초산용액

B: 0.1% 초산을 함유한 메탄올

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
15	50	50
25	30	70
30	80	20

검출기 파장

260 nm

유량

1.0 ml/분

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유량

0.3 ml/분

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 개미산용액

B: 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	95	5
5.0	5	95
5.5	95	5
6.0	95	5

이온화

ESI, positive

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

120℃

Desolvation Temp.

350℃

표 3. 질량분석기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)
Daidzin	417	255
Glycitin	447	285
Genistin	433	271
Daidzein	255	199, 137
Glycitein	285	242, 270
Genistein	271	153, 149

5.2 계산

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g)= C × (a×b)/S × 1/1,000

C  : 시험용액 중의 각 이소플라본(비배당체) 농도(μg/mL)

a  : 시험용액의 전량(mL)

b  : 희석배수

S  : 시료채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

* 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

제 4, 3, 3-64를 다음과 같이 한다.

3-64 총 폴리페놀

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 총 폴리페놀 함량을 구하는 방법으로 시료를 증류수에 용해하고 초음파 추출한 후 발색시약과 반응시켜 분광광도계를 사용하여 파장 760 nm에서 측정한 후, 비타민 C 함량을 제외한 값으로 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 시험관

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파 진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 자외분광광도계(UV/Visible Spectrophotometer)

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 탄닌산(Tannic acid)

분자식 : C76H52O46, 분자량 : 1701.2, CAS No. : 1401-55-4

3.2 일반시약

3.2.1 폴린데니스 시약(Folin-Denis Reagent)

3.3 시약의 제조

3.3.1 35% 탄산나트륨 용액(Sodium carbonate anhydrous)

탄산나트륨 35 g을 정밀히 달아 증류수 100 mL을 넣고 70℃에서 녹여 상온에 방치한 후 과포화된 용액에 Na2CO3·10H2O 결정이 생기면 유리솜(glass wool)으로 여과한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 탄닌산 10 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 증류수를 가하여 정용한다.

4.1.2 위의 표준원액을 증류수로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2. 시험용액의 조제

4.2.1 탄닌산으로 5∼10 mg에 상당한 양을 취하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 증류수를 소량 가한다.

4.2.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 증류수로 50 mL 정용한 후 적절히 희석하여 시험용액으로 한다.

4.2.4 증류수 7.5 mL를 시험관에 각각 취한다.

4.2.5 4.2.4의 시험관에 각각 표준용액, 시험용액 및 증류수(공시험용)를 1 mL씩 취한다.

4.2.6 4.2.5의 각 시험관에 Folin-Denis 시약 0.5 mL을 가한 후 35% 탄산나트륨 1 mL을 넣어 혼합한다.

4.2.7 암소에서 30분 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 분석 및 계산

5.1 결과 분석

5.1.1 표준물질의 농도별 흡광도와 공시험 흡광도의 차를 이용하여 표준물질의 검량선을 작성한다.

5.1.2 시료의 흡광도와 공시험 흡광도의 차를 이용하여 정량한다.

5.1.3 비타민 C가 총 폴리페놀 함량에 간섭하는 양을 보정하기 위해 시료 중 비타민 C의 함량을 「건강기능식품의 기준 및 규격」 중 제 4. 건강기능식품시험법 3-14 비타민 C(제3법)에 따라 미리 분석한다.

5.2 비타민 C 간섭보정계수 설정

5.2.1 시료 중 비타민 C가 총 폴리페놀 함량에 간섭하는 양을 보정하기 위해 순수한 비타민 C를 일정량(mg)(5.1.3에서 분석한 값과 근접한 값) 취한다.

5.2.2 4.2.1에서 4.2.7까지의 과정을 동일하게 수행한다.

5.2.3 흡광도로 측정한 비타민 C의 실험값을 이론값으로 나누어 비타민 C 간섭 보정계수를 설정한다.

5.3 계산

5.3.1 총 폴리페놀의 함량(탄닌산으로서)(mg/g) = [C × (a×b)/S] - (D × E/F)

C : 시험용액 중의 탄닌산의 농도(mg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료무게(g)

D : 5.1.3에서 측정한 비타민 C의 함량(mg/g)

E : 5.2.2에 따라 흡광도법으로 측정한 비타민 C의 함량(mg/g)

F : 5.2.1에서 취한 순수한 비타민 C의 함량(mg/g)

* [eqn: {E} over {F}] = 비타민 C 간섭 보정계수

제 4, 3, 3-67을 다음과 같이 한다.

3-67 깅콜릭산(Ginkgolic acid)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료 중 깅콜릭산(깅콜릭산 C13:0, C15:1, C17:1의 합)을 50% 에탄올과 클로로포름을 이용하여 2회 추출 후 클로로포름 층을 감압 농축한 것을 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(최대흡수파장 210 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(50 mL)

2.1.2 메스실린더(200 mL)

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터 및 디스크형 멤브레인 필터

2.1.5 액체크로마토그래피용 유리병

2.1.6 분액여두 (100 mL)

2.1.7 진탕기

2.1.8 감압농축기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도 검출기 또는 포토다이오드어레이 검출기

2.2.1.3 스위칭밸브

2.2.1.4 C8 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 5 μm, 전처리 컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.1.5 C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm, 분석컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(C18, 안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전입자크기 1.7 μm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 깅콜릭산 C15:1(Ginkgolic acid C15:1)

분자식 : C22H34O3, 분자량 : 346.50, CAS No. : 22910-60-7

3.1.2 깅콜릭산 C17:1(Ginkgolic acid C17:1)

분자식 : C24H38O3, 분자량 : 374.56, CAS No. : 111047-30-4

3.1.3 깅콜릭산 C13:0(Ginkgolic acid C13:0)

분자식 : C20H32O3, 분자량 : 320.47, CAS No. : 202617-38-5

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 클로로포름(Chloroform, HPLC grade)

3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.4 에탄올(Ethanol, HPLC grade)

3.2.5 인산(Phosphoric acid)

3.2.6 증류수(Distilled water)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 깅콜릭산 C15:1 50 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 메탄올로 용해한다.

4.1.2 깅콜릭산 C17:1 50 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 메탄올로 용해한다.

4.1.3 깅콜릭산 C13:0 50 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 메탄올로 용해한다.

4.1.4 위의 표준원액을 적정농도로 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 시료 1 g을 정밀하게 칭량하여 50% 에탄올 10 mL에 용해한 후 분액여두로 옮긴다.

4.2.2 분액여두에 클로로포름 50 mL를 가하여 진탕 추출한다.

4.2.3 클로로포름층을 별도로 취한 다음 남은 수용액 층에 대해서는 다시 에탄올 10 mL, 클로로포름 50 mL를 넣고 재추출한다.

4.2.4 클로로포름층을 모아 감압농축한 후 메탄올 5 mL를 가하여 녹인다.

4.2.5 위의 용액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 . 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목

조건

주입량

50 μL

검출기 파장

210 nm

컬럼온도

40℃

이동상

전처리용매 : 0.1% 인산을 함유한 70% 아세토니트릴

분석용매 : 이동상 A - 0.1% 인산

이동상 B – 아세토니트릴

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	30	70
4	30	70
30	5	95
32	5	95
32.1	30	70
40	30	70

유속

1.0 mL/분

분석 시간

40 분

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유속

0.53 mL/분

칼럼온도

40℃

이동상

A - 0.1% 개미산용액

B - 100 %아세토니트릴

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	30	70
0.33	30	70
5.43	20	80
8.26	20	80
8.32	30	70
10	30	70

이온화

ESI, Negative

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

150℃

Desolvation Temp.

200℃

표 3. 질량검출기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)	Cone(V)
Gingkolic Acid C13:0	319	119, 133, 275	25
Gingkolic Acid C15:1	345	119, 133, 301	25
Gingkolic Acid C17:1	373	119, 133, 329	30

5.2 계산

5.2.1 Ginkgolic acid C15:1, C17:1의 정량한계는 0.036 μg/mL으로, 정량한계 이하일 경우 불검출로 판정한다.

5.2.2 Ginkgolic acid C13:0의 경우 표준품 C15:1의 표준품을 이용한 RRT (relative retention time, 상대머무름시간)을 확인 하여 함량을 계산한다.

깅콜릭산(Ginkgolic acid C13:0, C15:1, C17:1) 함량(mg/kg) = C × (a × b)/S

C : 시험용액 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료채취량(g)

제 4, 3, 3-74, 3.3 중 “제조”를 “조제”로 하고, 3.3.1 중 “pH 8.0”을 “pH 6.8”로 한다.

제 4, 3, 3-74, 4, 4.1 4.1.3 중 “33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액”를 “33 mM Tris-HCl(pH 6.8) 완충용액”으로 한다.

제 4, 3, 3-74, 4, 4.2 중 “제조”를 “조제”로 하고, 4.2.3 “33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액”를 “33 mM Tris-HCl(pH 6.8) 완충용액”으로 한다.

제 4, 3, 3-74, 5, 5.1, 표1 중 “0.05 M NaCl(pH 3.5)”를 “0.01 M NaCl(pH 3.5)”으로 하고, 5.2.1을 다음과 같이 한다.

히알루론산의 함량(mg/g)

= C × (a × b)/S × 1/1,000 × 378.3/401.3

C : 시험용액중의 히알루론산의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

378.3 : 히알루론산 이당류의 분자량

401.3 : 히알루론산 나트륨 이당류의 분자량

제 4, 3, 3-79를 다음과 같이 한다.

3-79 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중 알파에스1카제인(f91-100)을 이동상으로 용해한 후 초음파 추출하여 최대흡수파장인 276 nm에서 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크 (50 mL)

2.1.2 용매용 일회용 실린지

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 알파에스1카제인(αS1-Casein)(f91-100)

분자식 : C60H94N14O16, 분자량 : 1267.50
Tyr1-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg10

3.2 일반시약

3.2.1 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid)

3.2.2 개미산(Formic acid)

3.2.3 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 알파에스1카제인 표준물질 10 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 추출용매로 정용한 후 표준원액으로 한다.

4.1.2 표준원액을 추출용매로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2. 추출용매의 조제

4.2.1 0.1% 트리플로우로아세트산이 첨가된 증류수와 0.1% 트리플루오르아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 74 : 26 (v:v)의 비율로 잘 혼합하여 사용한다.

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 알파에스1카제인으로 1.0∼1.5 mg에 상당하는 양을 취하여 50 mL 부피플라스크에 넣은 후, 추출용매를 넣어 시료를 녹인다.

4.3.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.3 위의 용액을 추출용매로 50 mL 정용하고 적절히 희석한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.3.4 시험용액을 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기로 분석하여 알파에스1카제인 함량을 구한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

표 1. 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 조건(예)

항목	조건
주입량	20 μL
칼럼온도	37℃
이동상	A: 0.1% 트리플루오르아세트산용액 B: 0.1% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴
검출기 파장	276 ㎚
유량	0.8 mL/분

표 2. 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이 동 상 (%)
	A	B
0	74	26
20	66	34
20.1	1	99
25	1	99
25.1	74	26
34	74	26

5.1.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

표 3. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A: 0.1% 개미산, 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유한 증류수 B: 0.1% 개미산, 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴
칼럼온도	40℃
유속	0.5 mL/분
주입량	5 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary voltage	2.0 kV
Cone voltage	30 V
Desolvation temperature	350℃
Monitor ions(m/z)	1268(precursor ion), 771, 658(product ion)

표 4. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	85	15
1	85	15
11	30	70
12	30	70
12.5	0	100
14	0	100
15.5	85	15
17	85	15

5.2 계산

5.2.1 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 함량(mg/g) = C × (a×b)/S

C : 시험용액 중의 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 농도(mg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료무게(g)

제 4, 3, 3-81을 다음과 같이 한다.

3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 메탄올성 수산화칼륨 용액을 처리한 후 클로로포름으로 글루코실세라미드를 추출하고 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정성 및 정량 분석하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피플라스크(10 mL 및 100 mL)

2.1.2 용매용 일회용 실린지

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 환저플라스크(250 mL)

2.1.6 회전진공증발농축기

2.2 분석장비

2.2.1 액체크로마토그래프

2.2.2 질량검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충진입자크기 1.7 μm, octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 곤약 글루코실세라미드(Konjac glucosylceramide, Funakoshi, NS170302 또는 NS170303)

분자식 : C42H79NO9, 분자량 : 742.08, CAS No. : 58173-44

3.2 일반시약

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 클로로포름(Chloroform)

3.2.3 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 글루코실세라마이드 50 mg을 50 mL 부피플라스크에 넣고 소량의 메탄올로 완전히 녹인 후 정용하여 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 글루코실세라미드로서 약 2.4 mg에 해당하는 시료를 100 mL 비이커에 넣고 0.4 N 메탄올성 수산화칼륨 용액 50 mL을 가한 후 2시간 동안 교반한다.

4.2.2 위액을 250 mL 분액여두로 옮기고 증류수 40 mL을 이용하여 비커를 씻어 분액여두에 합친다.

4.2.3 분액여두에 클로로포름 45 mL을 가하여 진탕 혼합하고 층 분리가 충분히 되도록 방치 한 후 클로로포름층을 환저플라스크로 옮긴다. 이 과정을 2회 더 반복한다.

4.2.4 환저플라스크로 옮긴 클로로포름층을 60℃에서 감압농축한 후 소량의 메탄올에 녹여 20 mL 부피플라스크에 옮긴 후 메탄올로 정용한다.

4.2.5 위의 시험용액을 메탄올로 적절히 희석한 후 0.2 μm  멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A용액 : 0.1% 개미산 B용액 : 0.1% 개미산 함유 메탄올
칼럼온도	40℃
유속	0.35 mL/min
주입량	1 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary Voltage	2.5 kV
Source Temp.	150℃
Desolvation temperature	350℃

표 2. 질량검출기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)	Cone(V)
글루코실세라미드	743	262	20

표 3. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	5	95
1.5	5	95
2.0	0	100
5.0	0	100
5.1	5	95
10	5	95

5.2 계산

5.2.1 글루코실세라미드(mg/g) = C × (a × b)/S × 1/1,000

C: 시험용액 중 글루코실세라마이드의 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 희석배수

S: 시료 채취량(g)

1/1,000: 단위 환산 계수

부 칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시한 날부터 즉시 시행한다.

제2조(적용례) 이 고시는 이 고시 시행 이후 최초로 제조·가공 또는 수입(선적일을 기준으로 한다. 이하 같다)한 건강기능식품(원료를 포함한다)부터 적용한다.

제3조(경과조치) ① 이 고시 시행 당시 검사가 접수되어 진행 중인 사항에 대하여는 종전의 규정에 따른다.

② 이 고시 시행 당시 종전의 규정에 따라 제조․가공․수입한 건강기능식품은 종전의 규정에 따른다. 이 경우 해당 건강기능식품은 유통기한까지 판매할 수 있다.

신․구조문대비표

현  행

개 정 안

제 1. 총칙

1. ～ 2.  (생  략)

3.  (생  략)

1) (생  략)

2) (생  략)

(1) ---- 영양소 ------- 영양소와----------------------.

제 1. 총칙

1. ～ 2. (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

1) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

(1) ---- 영양성분 ------- 영양성분과------------------.

제 2. 공통기준 및  규격

1. (생  략)

1) (생  략)

2) 영양소

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) (생  략)

(가)∼(다) (생  략)

(라) --- 2) 영양소. ---------------------------------------------------------------.

2. (생  략)

1)∼3) (생  략)

4) -----------영양소에서----- --------------------.

5) (생  략)

(1) (생  략)

(2) -------------- 영양소-------------------.

3. (생  략)

1)∼4) (생  략)

5) ------------------------------------------영양소의------영양소기준치---------------------.

6)∼7) (생  략)

표1] (생  략)

					<적용해야할 규격>
(생략)				→
				→
↓
2. (생략)				→	∘영양소 함량
↓
3. (생략)				→
↓
4. (생략)				→

제 2. 공통기준 및 규격

1. (현행과 같음)

1) (현행과 같음)

2) 영양성분

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) (현행과 같음)

(가)∼(다) (현행과 같음)

(라) --- 2) 영양성분. ---------------------------------------------------------------.

2. (현행과 같음)

1)∼3) (현행과 같음)

4) -----------영양성분에서-------------------------.

5) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) -------------- 영양성분-------------------.

3. (현행과 같음)

1)∼4) (현행과 같음)

5) ----------------------------------------영양성분의-------영양소성분기준치-----------------.

6)∼7) (현행과 같음)

표1] (현행과 같음)

					<적용해야할 규격>
(현행과 같음)				→
				→
↓
2. (현행과 같음)				→	∘영양성분 함량
↓
3. (현행과 같음)				→
↓
4. (현행과 같음)				→

제 3. 개별기준 및 규격

1. 영양소

1) ～ 2) (생  략)

3) -----------영양소기준치의--- -------------------------------------------------.

4) (생  략)

5) 영양소기준치의-----------------------영양소의-------------------.

6) (생  략)

<신  설>

제 3. 개별기준 및 규격

1. 영양성분

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) -----------영양성분기준치의--- -------------------------------------------------.

4) (현행과 같음)

5) 영양성분기준치의--------------------영양성분의--------------------.

6) (현행과 같음)

7) 6)의 규정에도 불구하고, 이 공전에서 정하는 원료의 목록에는 제시되어 있으나, 식품 또는 식품첨가물의 기준 및 규격에서 기준과 규격이 정하여지지 않은 원료에 대하여는 식품의약품안전처장은 국제식품규격위원회(Codex Alimentarius Commission, CAC) 규정 등 주요 선진외국의 기준 및 규격을 적용할 수 있다.

1-1 ～ 1-2 (생  략)

1-3 비타민 D

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) (생  략)

(2) ----- : 1.5～10 ug

4) (생  략)

1-1 ～ 1-2 (현행과 같음)

1-3 비타민 D

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) (현행과 같음)

(2) ----- : 3～10 ug

4) (현행과 같음)

1-4 ～ 1-10 (생  략)

1-11 엽산

1) (생  략)

(가) (생  략)

(나) 식품원료를 사용하여 엽산을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

<신  설>

2) ～ 4) (생  략)

1-12 ～ 1-16 (생  략)

1-4 ～ 1-10 (현행과 같음)

1-11 엽산

1) (현행과 같음)

(가) (현행과 같음)

(나) 메틸테트라히드로엽산글루코사민((6S)-5-Methyltetrahydrofolic acid, Glucosaming Salt))

(다) 식품원료를 사용하여 엽산을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

2) ～ 4) (현행과 같음)

1-12 ～ 1-16 (현행과 같음)

1-17 철

1) (생  략)

(가) ～ (타) (생  략)

(파) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

<신  설>

1-17 철

1) (현행과 같음)

(가) ～ (타) (현행과 같음)

(파) 구연산제일철나트륨(Sodium ferrous citrate)

(하) 식품원료를 사용하여 철을 보충할 수 있도록 제조·가공한 것

1-18 ～ 1-24 (생  략)

1-25 크롬

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) ----- : 0.015～9 mg

4) (생  략)

1-18 ～ 1-24 (현행과 같음)

1-25 크롬

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) ----- : 0.009～9 mg

4) (현행과 같음)

1-25 (생  략)

1-26 식이섬유 (생  략)

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) 영양소 기능

----------

(2) ～ (3) (생  략)

4) (생  략)

1-25 (현행과 같음)

1-26 식이섬유 (현행과 같음)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) 영양성분 기능

----------

(2) ～ (3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

1-27 단백질 (생 략)

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) 영양소 기능

----------

(2) ～ (3) (생  략)

4) (생  략)

1-27 단백질 (현행과 같음)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) 영양성분 기능

----------

(2) ～ (3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

1-28 필수지방산 (생 략)

1) ～ 2) (생  략)

3) (생  략)

(1) 영양소 기능

----------

(2) ～ (3) (생  략)

4) (생  략)

1-28 필수지방산 (현행과 같음)

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

(1) 영양성분 기능

----------

(2) ～ (3) (현행과 같음)

4) (현행과 같음)

[별표 1] (생  략)

[별표 2] 영양소 기준치

영양소	기준치	영양소	기준치	영양소	기준치
탄수화물(g)	330	철분(㎎)	12	판토텐산(㎎)	5
식이섬유(g)	25	비타민D(㎍)	5	인(㎎)	700
단백질(g)	55	비타민E(㎎α-TE)	11	요오드(㎍)	150
지방(g)	51	비타민K(㎍)	70	마그네슘(㎎)	315
포화지방(g)	15	비타민B1(㎎)	1.2	아연(㎎)	8.5
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B2(㎎)	1.4	셀렌(㎍)	55
나트륨(㎎)	2,000	나이아신(㎎ NE)	15	구리(㎎)	0.8
칼륨(㎎)	3,500	엽산(㎍)	400	망간(㎎)	3.0
비타민A(㎍ RE)	700	비타민B6(㎎)	1.5	크롬(㎍)	50
비타민C(㎎)	100	비타민B12(㎍)	2.4	몰리브덴(㎍)	25
칼슘(㎎)	700	비오틴(㎍)	30

[별표 3] 한국인 영양섭취기준

<별첨 1>

[별표 1] (현행과 같음)

[별표 2] 1일 영양성분 기준치

영양성분	기준치	영양성분	기준치	영양성분	기준치
탄수화물(g)	324	크롬(㎍)	30	몰리브덴(㎍)	25
당류(g)	100	칼슘(㎎)	700	비타민B12(㎍)	2.4
식이섬유(g)	25	철분(㎎)	12	비오틴(㎍)	30
단백질(g)	55	비타민D(㎍)	10	판토텐산(㎎)	5
지방(g)	54	비타민E(㎎α-TE)	11	인(㎎)	700
포화지방(g)	15	비타민K(㎍)	70	요오드(㎍)	150
콜레스테롤(㎎)	300	비타민B1(㎎)	1.2	마그네슘(㎎)	315
나트륨(㎎)	2,000	비타민B2(㎎)	1.4	아연(㎎)	8.5
칼륨(㎎)	3,500	나이아신(㎎ NE)	15	셀렌(㎍)	55
비타민A(㎍ RE)	700	비타민B6(㎎)	1.5	구리(㎎)	0.8
비타민C(㎎)	100	엽산(㎍)	400	망간(㎎)	3.0

[별표 3] 한국인 영양섭취기준

<별첨 1>

2. 기능성 원료

2-1 ～ 2-16 (생  략)

2-17 감마리놀렌산 함유 유지

1) ～ 2) (생  략)

3) 최종제품의 요건

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 섭취 시 주의사항

---------------------------

<신  설>

2. 기능성 원료

2-1 ～ 2-16 (현행과 같음)

2-17 감마리놀렌산 함유 유지

1) ～ 2) (현행과 같음)

3) 최종제품의 요건

(1) ～ (2) (생  략)

(3) 섭취 시 주의사항

---------------------------

(면역과민반응에 의한 피부상태 개선에 도움을 줄 수 있음에 한함)

제 4. 건강기능식품 시험법

1. ～ 2. (생  략)

3. 개별 성분별 시험법

3-1 ～ 3-3 (생  략)

3-4 비타민 E

3-4-1 비타민 E(제1법)

1. ～ 4.  (생  략)

5. 계산

5.1.1 -----------------------

A : ----------- 베타카로틴의 -------

- : -----------------------

- : -----------------------

- : -----------------------

제 4. 건강기능식품 시험법

1. ～ 2. (현행과 같음)

3. 개별 성분별 시험법

3-1 ～ 3-3 (현행과 같음)

3-4 비타민 E

3-4-1 비타민 E(제1법)

1. ～ 4.  (생  략)

5. 계산

5.1.1 -----------------------

A : ----------- 토코페롤의   -------

- : -----------------------

- : -----------------------

- : -----------------------

3-5 ～ 3-16 (생  략)

3-5 ～ 3-16 (현행과 같음)

3-17 요오드(생  략)

<신  설>

3-17 요오드

3-17-1 요오드(제1법)(현행과 같음)

3-17-2 요오드 (제2법)

1. 시험방법의 요약

본 시험법은 시료 중에 존재하는 요오드를 마이크로웨이브 분해 장치에 넣고 테트라메틸암모늄하이드록사이드(TMAH) 용액으로 분해하여 유도결합플라즈마/질량분석기로 정량하는 방법이다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 50 mL용 폴리프로필렌 부피플라스크

2.2 분석장비

2.2.1 유도결합플라즈마/질량분석기

2.2.2 마이크로웨이브 분해 장치

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 요오드화칼륨(Potassium iodide)

분자식 : KI, 분자량 : 166.0,

CAS No. : 7681-11-0

3.2 일반시약

3.2.1 25% 테트라메틸암모늄하이드록사이드(Tetramethylammonium hydroxide, TMAH)

3.2.2 증류수

4. 시험과정

4.1 시약조제

4.1.1 5% TMAH: 25% TMAH 100 mL을 취하여 증류수로 500 mL로 한다.

4.2 표준용액 조제

4.2.1 내부 표준용액: 시판 Te 표준용액(1,000 μg/mL) 1 mL를 취하여 증류수로 500 mL로 한다(Te 2 μg/mL 함유)

4.2.2 요오드 표준용액: 요오드화칼륨  0.1308 g을 취하고 증류수를 가하여 100 mL(1,000 μg/mL)로 한다. 다시 증류수로 희석하여 1 μg/mL으로 한다. 이 용액 일정량을 취하여 각각 50 mL 용 폴리프로필렌 부피 플라스크에 넣고 0.5% TMAH 용액으로 정용한다. 이들 용액 10 mL에 내부표준용액 100 μL를 가한 것을 표준용액으로 한다.

4.3 시험용액 조제

4.3.1 균질화된 시료 약 0.5 g을 마이크로웨이브 분해장치에 넣고 5% TMAH 용액을 적절히 가하여 90℃, 1시간동안 분해한다.

4.3.2 분해액을 방냉시킨 후 50 mL 용 폴리프로필렌 부피플라스크에 넣고 증류수를 가하여 정용한다.

4.3.3 검량선 범위에 들어가게 0.5% TMAH로 적절히 희석한다.

4.3.4 이 액 10 mL를 취하여 내부표준용액 100 μL를 가한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 표. ICP-MS 측정 조건(예)

항목	조건
기기	ICP-MS
시료 도입 유속	1.0 mL/min
RF 파워	1.1 kw
플라즈마 기체	아르곤(15 L/min)
이동상 기체	아르곤(0.7 L/min)
메이크업 기체	아르곤(0.29 L/min)
m/z	요오드(I) 127 내부표준물질(Te): 128
세척용매	0.5% TMAH

5.2 계산

5.2.1 요오드 함량(ng/g) = C × (a × b)/S

C : 검량선에서 구한 시험용액 중 요오드 농도(ng/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

3-17 ～ 3-24 (생  략)

3-17 ～ 3-24 (현행과 같음)

3-25 베타글루칸

1. 시험방법의 요약
----- 시료의 베타글루칸을 효소처리하여 글루코오스 형태로 분해하고 발색시켜 분광광도계로 정량하는 방법이다. 이때 글루코오스를 표준물질으로 사용하며 ---------------------- 정량분석 한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 ∼ 2.1.4 (생  략)

2.1.5 ------(100 mL)

2.2 ∼ 2.3 (생  략)

3. (생  략)

3.1. (생  략)

3.2. 일반시약

3.2.1 ∼ 3.2.6 (생  략)

<신  설>

3.3. (생  략)

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.2 (생  략)

4.2.1 (생  략)

4.2.2 시료 약 2∼10 g을 정밀히 달아 -------------------- ------------------------- -----------------------에탄올 용액으로 시료 1 g당 10 mL 씩으로 ----).

4.2.3 --- 100 mL-----.

4.2.4 ---------(20unit) 약 40∼200 mg을 취한다.

4.2.5 ------------------------ ------------- 20℃에서 ---- ---------------------------------.

4.2.6 -------------------- -----------------------------(50unit)를-------- -------------------------------------------------.

4.2.7 --------------- (10unit) 약 15∼80 mg을 --------------------------------------- 37℃에서--------------------- ---.

4.2.8 --------------- ---(70unit) 약 20∼100 mg을 ------------------------------------------60℃에서 --------------------- -----------.

4.2.9 -----[4.2.8]-----------  400 mL----------------- --------.

4.2.10 ---------------(10,000 rpm, 10분)-------------- ----.

4.2.11 ------[4.2.10]---------- 500 mL-------------------- ------------.

4.2.12 --------------------

(10,000 rpm, 10분)--.

4.2.13 --------------[4.2.12]- --- 20 mL--------------- ----------------.

4.2.14 ------------ 100 mL- ----------------------- ----------------------.

4.3 (생  략)

4.3.1 25 mL ---------------- ---------------------------------------------------------------.

4.3.2 ∼ 4.3.4 (생  략)

5. (생  략)

5.1 (생  략)

5.2  (생  략)

5.2.1 -------------

= C × a/S × 10 × 1/1,000 × 0.9

- : ---------------------

- : -------------

10 : ----

- : -------

<신  설>

---- : ---------

-- : --------------------

3-25 베타글루칸

3-25-1 베타글루칸(제 1법 영지버섯자실체추출물)

1. 시험방법의 요약
----- 시료를 효소처리하여 베타글루칸만을 침전 시킨 후 글루코오스 형태로 분해하고 발색시켜 분광광도계로 정량하는 방법으로 영지버섯자실체추출물에 적용하며 --------------------에서 분석 한다.

2. (현행과 같음)

2.1∼ 2.1.4 (현행과 같음)

2.1.1∼ 2.1.4 (현행과 같음)

2.1.5 ------(50 mL)

2.2 ∼ 2.3 (현행와 같음)

3. (현행과 같음)

3.1. (현행과 같음)

3.2. 일반시약

3.2.1 ∼ 3.2.6 (현행과 같음)

3.2.7 황산(Sulfuric acid)

3.2.8 페놀(Phenol)

3.2.9 0.1 N 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.3. (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.2 (현행과 같음)

<삭  제>

4.2.1 베타글루칸으로서 100 mg의 시료를 ------------------ ------------------------ ---------------------- 에탄올 용액을 이용하여 베타글루칸 20 mg당 10 mL씩으로------).

4.2.2 --- 10 mL------.

4.2.3 여기에 아밀라아제(20,000∼60,000 U/mL) 0.1 mL을 가한다.

4.2.4 ------------------- ------------- 20℃ 항온수조에서--------------------- --------.

4.2.5 ----------------- ----------------------------(1,600 U/mL)를 0.1 mL ---------------------------------------------------.

4.2.6 위의 용액에 프로테아제(600∼1,300 U/mL) 약 0.1 mL을 -- ----------------------- ----------- 37℃ 항온수조에서 ------------------------ ---.

4.2.7 ---------------- ---(10,000 U/mL) 약 0.1 mL-------------------------------------60℃ 항온수조에서-------------- ---------.

4.2.8 -----[4.2.7]------------- 40 mL----------------------- --------.

4.2.9 ----------------(3,000 × G, 20분)--------------- ----.

4.2.10 -----[4.2.9]------------ 50 mL-------------------- --------.

4.2.11 ------------------(3,000 × G, 20분)--.

4.2.12 -------------[4.2.11]- --- 10 mL--------------- ------------.

4.2.13 --------------- 50 mL-  ----------------------------- ----------------------------.

4.3 (현행과 같음)

4.3.1	15 mL ------------- ------------------------- ------------------------------------.

4.3.2 ∼ 4.3.4 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.2  (현행과 같음)

5.2.1 -------------

= C × (a × b)/S × 10 × 1/1,000 × 0.9

- : ---------------------

- : --------------

b : ----

- : -------

10: 발색과정의 희석배수

---- : --------

-- : --------------------

<신  설>

3-25-2 베타글루칸(제2법 상황버섯추출물)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료에 있는 총 글루칸에서 베타글루칸 외의 글루칸 함량을 제거하여 베타글루칸의 값을 구한다. 산분해와 효소처리를 하여 글루코오스 형태로 분해한 후 발색시켜 분광광도계로 정량하는 방법으로 상황버섯추출물에 적용하며 최대흡수파장인 470 nm에서 분석 한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 분석저울

2.1.2 항온수조

2.1.3 pH 미터

2.1.4 부피플라스크(100 mL)

2.1.5 마개 있는 50 mL 유리시험관, 5 mL 시험관

2.1.6 원심분리기

2.1.7 교반기

2.1.8 유리섬유여과지(Whatman GF/A 유리섬유 필터 또는 이와 동등한 것)

2.2 분석장비

2.2.1 분광광도계

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 글루코오스(D-(+)-glucose)

분자식 : C6H12O6, 분자량 : 180.16, CAS No. : 50-99-7

3.2 일반시약

3.2.1 수산화칼륨(Potassium hydroxide)

3.2.2 초산(Acetic acid)

3.2.3 진한염산(Hydrochloric acid, 37%(v/v))

3.2.4 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

3.2.5 버섯효모베타글루칸 분석키트(Mushroom and Yeast Beta-glucan assay procedure Kit, Megazyme, K-YBGL, Ireland)

[키트의 구성]

① Bottle 1 : 1,3-베타글루카나아제(1,000 U/mL), 베타글루코시다아제(20 U/mL) 혼합액

② Bottle 2 : Amyloglucosidase(1,630 U/mL), Invertase(500 U/mL), 50% 글리세린 혼합액

③ Bottle 3 : 포도당 반응 완충액

④ Bottle 4 : 포도당 측정 반응액(글루코오스 옥시다아제 12,000 U/L 이상, 페록시다아제 650 U/L 이상, 4-아미노안티피린 0.4 mM)

3.2.6 증류수

3.3 시액의 조제

3.3.1	4 M 수산화나트륨용액

수산화나트륨 80.0 g을 증류수로 용해하여 500 mL로 정용한다.

3.3.2 200 mM 초산완충액(Acetate buffer, pH 5.0)

초산 11.6 mL를 900 mL 증류수에 용해한 후 4 M 수산화나트륨용액으로 pH를 5.0으로 맞추어 1 L로 정용한다.

3.3.3 1.2 M 초산완충액(Acetate buffer, pH 3.8)

초산 69.6 mL를 800 mL 증류수에 용해한 후 4 M 수산화나트륨용액으로 pH를 3.8로 맞추어 1 L로 정용한다.

3.3.4 2 M 수산화칼륨용액

수산화칼륨 112 g을 증류수로 용해하여 1 L로 정용한다.

3.3.5 베타글루칸 효소혼합액

K-YBGL의 Bottle 1에 200 mM 초산완충액(pH 5.0) 8 mL을 첨가한다. 1 mL 씩 나누어 –20℃에서 보관한다.

3.3.6 알파글루칸 효소혼합액

K-YBGL에 들어있는 Bottle 2를 그대로 사용한다.

3.3.7 발색시약 (GOPOD)

K-YBGL에 들어있는 Bottle 3 전량을 1L 부피플라스크에 넣은 후 증류수로 희석하고 1 L로 정용한다. 이 용액 소량으로 Bottle 4 전량을 녹이고 다시 Bottle 3가 녹아있는 이전 1L 부피플라스크에 넣어 충분히 섞은 후 사용한다. 40 mL 씩 나누어 –20℃에서 보관한다.

4. 시험과정

4.1 표준용액의 제조

4.1.1 D-글루코오스 표준물질 500 mg을 50 mL 부피플라스크에 넣는다

4.1.2 증류수를 가하여 완전히 녹인 후 표선까지 정용하여 표준원액으로 한다.

4.1.3 표준원액을 증류수로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

4.2 시험용액의 제조

4.2.1 총 글루칸 측정

4.2.1.1 시료는 0.5 mm의 체를 통과할 수 있도록 분쇄한다

4.2.1.2 마개가 있는 50 mL 유리시험관에 베타글루칸으로서 10 mg에 해당하는 시료를 칭량한다.

4.2.1.3 진한 염산을 각 시험관에 1.5 mL씩 가한 후 덩어리가 생기지 않도록 강하게 교반한 후 40℃ 항온수조에서 45분간 반응시킨다.

4.2.1.4 각 시험관에 증류수 10 mL를 첨가하고 강하게 교반한다.

4.2.1.5 시험관 뚜껑을 완전히 닫지 않은 상태로 100℃ 항온수조에서 5분간 방치한 후 뚜껑을 완전히 닫아 2시간 반응시킨다.

4.2.1.6 반응 후 실온까지 냉각하여 2 M 수산화칼륨용액을 10 mL 가한다.

4.2.1.7 200 mM 초산완충액으로 시험관의 잔여물을 남기지 않고 100 mL 부피플라스크로 옮긴 후 표선까지 정용한다.

4.2.1.8 유리섬유여과지(Whatman GF/A)를 이용하여 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.1.9 시험용액 0.1 mL을 새로운 5 mL 시험관에 옮긴 후 베타글루칸 효소혼합액 0.1 mL을 각 시험관에 가하여 40℃에서 30분간 반응시킨다(총 글루칸 측정 효소공시험 시험관에 200 mM 초산완충액 0.1 mL와 베타글루칸 효소혼합액 0.1 mL을 첨가하고, 발색시약 공시험 시험관에 200 mM 초산완충액 0.2 mL를 가한 후 다음단계부터 함께 반응시킨다).

4.2.1.10 반응 후 발색시약(GOPOD) 3 mL를 가하여 실온에서 10분간 반응시킨다.

4.2.1.11 증류수를 대조액으로 분광광도계 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

4.2.2 베타글루칸을 제외한 글루칸 측정

4.2.2.1 시험관에 베타글루칸으로서 10 mg에 해당하는 시료를 칭량한다(효소공시험을 동시에 진행한다).

4.2.2.2 2 M 수산화칼륨용액을 각 시험관에 2 mL씩 가한 후 덩어리가 생기지 않도록 강하게 교반한다(덩어리가 생겨 제거되지 않을 경우 실온에 20분간 방치한 후 강하게 교반한다).

4.2.2.3 1.2 M 초산완충액 8 mL을 가하여 강하게 교반한 후 알파글루칸 효소혼합액 0.2 mL을 가하여 40℃ 항온수조에서 30분간 반응시킨다.

4.2.2.4 반응액을 원심분리(1,500 × G, 10분)하여 시험용액으로 한다.

4.2.2.5 시험용액 0.1 mL을 새로운 시험관에 옮긴 후 발색시약(GOPOD) 3 mL를 각 시험관에 가하여 실온에서 10 분간 반응시킨다.

4.2.2.6 증류수를 대조액으로 분광광도계 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

5. 분석 및 계산

5.1 흡광도 측정

5.1.1 증류수를 대조액으로 하여 파장 510 nm에서 흡광도를 측정한다.

5.2 계산

5.2.1 농도별 표준용액의 흡광도에서 발색시약 공시험 흡광도를 뺀 값을 검량선 작성에 이용한다.

5.2.3.2 총 글루칸 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × 0.9

5.2.3.3 베타글루칸을 제외한 글루칸의 함량(mg/g) = C × (a × b)/S × 0.9

5.2.3.4 베타글루칸 함량(mg/g)

= 총 글루칸 함량(mg/g) - 베타글루칸을 제외한 글루칸의 함량(mg/g)

C :  시험용액의 농도(μg/mL)

a： 시험용액의 전량(mL)

b： 희석 배수

S： 시료중량（mg）

0.9： 베타글루칸 전환계수(162/180)

3-26 ～ 3-46 (생  략)

3-26 ～ 3-46 (현행과 같음)

3-47 카테킨

1. 시험방법의 요약

--------------------------- --------------------------------280 nm--------.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.2 (생  략)

2.2.1 ～ 2.2.3 (생  략)

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 분석장비의 준비

3. (생  략)

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 4가지 표준물질 10 mg을 각각 10 mL----------------------.

4.1.1 ～ 4.1.2 (생  략)

4.13. 적당량 희석하여 검량선 작성에 사용한다.

4.2 (생  략)

4.2.1 --------------------- --------------합계로서------- ------------------메탄올을 가하여-----------.

<신  설>

4.2.2 메탄올을-------------- ------------------.

<신  설>

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. (생  략)

항목	조건
---	20 μL
----	280 nm
----	40℃
---	A : 0.1% 초산용액, B : 100% 아세토니트릴
--	-----

표 2. (생  략)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	95	5
20	75	25
21	0	100
35	0	100
36	95	5
50	95	5

3-47 카테킨

1. 시험방법의 요약

--------------------------- --------------------------------275 nm--------.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 ～ 2.2.3 (현행과 같음)

2.2.4 YMC-triart C18(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전입자크기 5 μm) 컬럼 또는 이와 동등한 것

<삭  제>

3. (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.1.1 표준물질(EGC, EGCG, EC, ECG) 각각 50 mg씩 50 mL----------------------.

4.1.1 ～ 4.1.2 (현행과 같음)

4.13. 50% 메탄올로 적당량 희석하여 표준용액으로 사용한다(표준용액은 사용 시 조제한다)

--------------------------- ---------------------------------------

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 --------------------- --------------합으로서------- ------------------50% 메탄올을 가한 후 20분간-----------. 필요한 경우 원심분리한다.

4.2.2 실온까지 식힌 후 50% 메탄올을----------------------.

되도록 시험용액은 조제 후 즉시 기기분석한다.

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. (현행과 같음)

항목	조건
---	10 μL
----	275 nm
----	35℃
---	A 용액 - 0.1% 인산용액 B 용액 - 0.1% 초산이 함유된 아세토니트릴
--	-----

표 2. (생  략)

시간(분)	A 용액(%)	B 용액(%)
0	90	10
2	90	10
3	85	15
10	80	20
12	10	90
16	10	90
17	90	10
20	90	10

3-49 총 플라보노이드

1～3. (생  략)

4. (생  략)

4.1～4.2 (생  략)

4.3 (생  략)

4.3.1 ---------------대조액과 시험액용으로---------------.

5. (생  략)

5.1 결과 분석(예)

5.1.1 (생  략)

5.1.2 --------------------- ------------적용시킨다.

3-49 총 플라보노이드

1～3. (현행과 같음)

4. (현행과 같음)

4.1～4.2 (현행과 같음)

4.3 (현행과 같음)

4.3.1 ---------------공시험용과 시험용으로---------------.

5. (현행과 같음)

5.1 결과 분석

5.1.1 (현행과 같음)

5.1.2 --------------------- ------------적용시켜 시료 중 총 플라보노이드의 함량을 구한다.

3-50 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinnamic acid)

3-50-1 ～ 3-50-2 (생  략)

3-50 파라(ρ)-쿠마르산(Coumaric acid), 계피산(Cinnamic acid)

3-50-1 ～ 3-50-2 (현행과 같음)

<신  설>

3-50-3 계피산(Cinnamic acid) 확인(제2법)

1. 시험방법의 요약
본 시험법은 시료 중 계피산을 20% 아세토니트릴에 용해한 후 초음파 추출하고, 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정성 분석한다.

2. 장비와 재료

2.1 실험실 장비 및 소모품

2.1.1 부피 플라스크(50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파진탕기

2.2 분석장비

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제  octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

3. 표준물질 및 일반시약

3.1 표준물질

3.1.1 계피산(Cinnamic acid, trans-3- Phenylacrylic acid)

분자식 : C9H8O2, 분자량 : 148.16, CAS No. : 140-10-3

3.2 일반시약

3.2.1 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.2 개미산(Formic acid)

4. 시험과정

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 계피산 10 mg을 정밀하게  50 mL 부피플라스크에 취한 후 20% 아세토니트릴을 가하여 정용한 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 20% 아세토니트릴로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다(10 ∼ 500 μg/L).

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 시료 약 2 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 20% 아세토니트릴로 정용한다.

4.2.2 위의 용액을 30분간 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 20% 아세토니트릴로 적절히 희석한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. 분석 및 계산

5.1 기기분석

5.1.1 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A: 0.1 % 개미산용액 B: 0.1 % 개미산을 함유한 아세토니트릴
칼럼온도	40℃
유속	0.3 mL/분
주입량	2 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary voltage	3.0 kV
Cone voltage	26 V
Desolvation temperature	350 ℃
Monitor ions(m/z)	149(precursor ion), 103, 77(product ion)

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
0.1	80	20
3	5	95
4	5	95
4.1	80	20
6	80	20

5.2 정성 확인

5.2.1 시험한 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 머무름 시간과 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)으로 계피산을 확인한다.

3-51～3-53 (생  략)

3-51～3-53 (현행과 같음)

3-54 대두이소플라본

3-54-1 대두이소플라본(제1법)

1. 시험방법의 요약

----- 메탄올을 ---------- ------- 추출하여 ---------- -------------------------를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량분석 한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 ----------(100 mL)

2.1.2 (생  략)

2.1.3 액체크로마토그래프용 유리병

2.2 (생  략)

2.2.1 고속액체크로마토그래프

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2.2 자외부흡광광도검출기

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 (생  략)

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.2 (생  략)

3.2.1∼3.2.4 (생  략)

3.2.5 <신  설>

4. (생  략)

4.1 ---- 제조

4.1.1∼4.1.4 (생  략)

4.1.5 --------------------- -----------------------<신  설>

4.2 (생  략)

4.2.1 시료 약 0.5 g을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 메탄올로 정용한다.

<신  설>

<신  설>

4.2.2 30분간 초음파 처리한다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2.3 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. (생  략)

항목	조건
---	10 μL
----	----
---	A : 물/메탄올/초산(88:10:2) B : 메탄올/초산(98:2)
----	260nm
----	1.0ml/분

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액(%)	B용액(%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

5.2 (생  략)

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g) = A×(B/S)×P×(1/1,000)

A : 시료의 농도(μg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료채취량(g)

P : 표준품의 순도

※ 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

3-54 이소플라본

3-54-1 이소플라본(제1법)

1. 시험방법의 요약

------ 80% 메탄올을 ---------- ---------- 추출하고 ----------- --------------------------(최대흡수파장 260 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 이소플라본 중 배당체 및 비배당체를 정량분석 한다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 -------(10 mL, 50 mL)

2.1.2 (현행과 동일)

<삭 제>

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

<삭  제>

<삭  제>

2.3 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.2 (현행과 같음)

3.2.1∼3.2.4 (현행과 같음)

3.2.5 개미산(Formic acid)

4. (현행과 같음)

4.1 ---- 조제

4.1.1∼4.1.4 (현행과 같음)

4.1.5 -------------------- -----------------------(표준용액 농도 범위 0.1～80 μg/mL)

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 분말형제품

4.2.1.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취하여 80% 메탄올로 정용한다.

4.2.1.2 30분간 초음파 처리한다.

4.2.1.3 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.2 유지형제품

4.2.2.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2.2 클로로포름 2 mL을 넣어 충분히 분산시킨다.

4.2.2.3 80% 메탄올로 정용한 후 30분간 초음파 처리한다.

4.2.2.4 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

<삭  제>

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. (현행과 같음)

항목

조건

---

5 μL

-----

---

---

A : 0.1% 초산용액

B : 0.1% 초산을 함유한 메탄올

시간 (분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
15	50	50
25	30	70
30	80	20

------

----

--

----

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유량

0.3 ml/분

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 개미산용액

B: 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴

시간 (분)	이동상(%)
	A	B
0	95	5
5.0	5	95
5.5	95	5
6.0	95	5

이온화

ESI, positive

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

120℃

Desolvation Temp.

350℃

표 3. 질량분석기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)
Daidzin	417	255
Glycitin	447	285
Genistin	433	271
Daidzein	255	199, 137
Glycitein	285	242, 270
Genistein	271	153, 149

5.2 (현행과 같음)

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g) = C × (a×b)/S × 1/1,000

C : 시험용액 중의 각 이소플라본(비배당체) 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

* 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

3-54-2 대두이소플라본(제2법)

1. -------

------ 메탄올을 이용하여 시료 중 이소플라본을 추출하여 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석하는 방법으로 최대 흡수파장인 260 nm에서 정량분석 한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 삼각플라스크(250 mL)

2.1.2 항온수조

2.1.3 원심분리기

2.1.4 용매용 일회용 실린지

2.1.5 여과용 멤브레인 필터

2.1.6 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.7 부피플라스크(50 mL)

2.2 (생  략)

2.2.1 고속액체크로마토그래프

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2.2 자외부흡광광도검출기

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2.3 칼럼오븐

2.2.4 옥타데실실릴화한한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

2.3 (생  략)

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 이소플라본류

3.1.1.1 다이드진(Daidzin)

3.1.1.2. 글리시틴(Glycitin)

3.1.1.3. 제니스틴(Genistin)

3.1.1.4. 다이드제인(Daidzein)

3.1.1.5. 제니스테인(Genistein)

3.1.1.6. 글리시테인(Glycitein)

3.2 (생  략)

3.2.1 메탄올(Methanol)

3.2.2 초산(Acetic acid)

3.2.3 증류수(Distilled water)

3.2.4 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

<신  설>

<신  설>

4. (생  략)

4.1 ---- 제조

4.1.1∼4.1.4 (생  략)

4.1.5 --------------------- ------------------------<신  설>

4.2 (생  략)

4.2.1 시료 1～10 g을 정밀히 취한다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2.2 위의 시료를 250 mL 삼각플라스크에 넣는다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.2.3 여기에 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 호일을 씌운다.

4.2.4 65℃ 항온수조에서 2시간 추출한다.

4.2.5 냉각시킨 후 2M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣는다.

4.2.6 이를 상온에서 10분간 회전 교반한 후 초산 1 mL를 넣는다.

4.2.7 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 하여 하고 혼합한다.

4.2.8 여액 5 mL에 증류수 4 mL를 넣고 메탄올을 사용하여 10 mL로 한다.

4.2.9 원심분리(5,000 rpm, 5분)한 상등액을 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한다.

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. (생  략)

항목	조건
---	10 μL
----	---
---	A : 물/메탄올/초산(88:10:2) B: 메탄올/초산(98:2)
-----	----
----	----

표 2. 이동상 조건(예)

시간	A용액 (%)	B용액 (%)
0	90	10
21	60	40
32	60	40
35	40	60
36	90	10

<신  설>

5.2 (생  략)

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g) = A×(B/S)×P×(1/1,000)

A : 시료의 농도(μg/mL)

B : 시험용액의 전량(mL)

S : 시료채취량(g)

P : 표준품의 순도

※ 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

3-54-2 이소플라본(제2법)

1. --------

----- 염기성가수분해를 통해 시료에 존재하는 이소플라본 중 아세틸배당체, 말로닐배당체를 배당체로 전환시켜 함께 정량할 수 있는 방법으로, 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(최대흡수파장 260 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 정량분석 한다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 부피플라스크(10 mL, 50 mL)

2.1.2 여과용 멤브레인 필터

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6mm, 길이 250mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

<삭  제>

<삭  제>

2.3 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.1.1 다이드진(Daidzin)

3.1.2. 글리시틴(Glycitin)

3.1.3. 제니스틴(Genistin)

3.1.4. 다이드제인(Daidzein)

3.1.5. 제니스테인(Genistein)

3.1.6. 글리시테인(Glycitein)

<삭  제>

3.2 (현행과 같음)

3.2.1 메탄올(Methanol, HPLC grade)

3.2.2 아세토니트릴(Acetonitrile, HPLC grade)

3.2.3 초산(Acetic acid)

3.2.4 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide)

3.2.5 개미산(Formic acid)

3.2.6 수산화나트륨(Sodium hydroxide)

4. (현행과 같음)

4.1 ---- 조제

4.1.1∼4.1.4 (현행과 동일)

4.1.5 -------------------- -----------------------(표준용액 농도 범위 0.1～80 μg/mL).

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 분말형제품

4.2.1.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.1.2 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 30분간 초음파 추출한다.

4.2.1.3 2M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣고 상온에서 10분간 회전교반한다.

4.2.1.4 초산 1 mL를 넣고 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 정용한다.

4.2.1.5 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

4.2.2 유지형제품

4.2.2.1 균질화한 시료 일정량(검량선 내 들어갈 수 있도록)을 50 mL 부피플라스크에 정밀히 취한다.

4.2.2.2 클로로포름 2 mL을 넣어 충분히 분산시킨다.

4.2.2.3 80% 메탄올 40 mL를 넣은 후 30분간 초음파 추출한다.

4.2.2.4 2M 수산화나트륨용액 3 mL를 넣고 상온에서 10분간 회전교반한다.

4.2.2.5 초산 1 mL를 넣고 80% 메탄올을 사용하여 50 mL로 정용한다.

4.2.2.6 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. (현행과 같음)

항목

조건

주입량

5 μL

----

--

---

A: 0.1% 초산용액

B: 0.1% 초산을 함유한 메탄올

시간 (분)	이동상(%)
	A	B
0	80	20
15	50	50
25	30	70
30	80	20

----

----

--

---

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유량

0.3 ml/분

칼럼온도

40℃

이동상

A : 0.1% 개미산용액

B: 0.1% 개미산을 함유한 아세토니트릴

시간 (분)	이동상(%)
	A	B
0	95	5
5.0	5	95
5.5	95	5
6.0	95	5

이온화

ESI, positive

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

120℃

Desolvation Temp.

350℃

표 3. 질량분석기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)
Daidzin	417	255
Glycitin	447	285
Genistin	433	271
Daidzein	255	199, 137
Glycitein	285	242, 270
Genistein	271	153, 149

5.2 (현행과 같음)

5.2.1 각 이소플라본(비배당체) 함량(mg/g) = C × (a×b)/S × 1/1,000

C : 시험용액 중의 각 이소플라본(비배당체) 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

* 이소플라본 배당체일 경우 1/1.6(0.625) 전환계수 적용함

3-55 ～ 3-63 (생  략)

3-55 ～ 3-63 (현행과 같음)

3-64 총 폴리페놀

1. (생  략)

--------------------------- -------------------------------------------------- 정량하는 방법이다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 -------(100 mL)

2.1.2 (생  략)

2.1.3 수용성 일회용 실린지

<신  설>

2.2 (생  략)

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.2 (생  략)

3.2.1 (생  략)

3.2.2 증류수(Distilled water)

3.3 시액-----

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 ---------- 정밀히 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 넣고 증류수로 표선까지 채운다.

4.1.2 ---------------- 적정 농도 희석하여 ----------- ----.

4.2 (생  략)

4.2.1 시료 100 mg을 칭량하여 100 mL 부피플라스크에 담는다.

4.2.2 증류수를 넣어 표선까지 맞춘 후 초음파 처리하여 용해시킨다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

4.3 시험조작

4.3.1 증류수 7.5 mL를 시험관에 취한다.

4.3.2 위의 시험관에 표준용액 및 시험용액을 각각 1 mL을 취한다.

4.3.3 Folin-Denis 시약 0.5 mL, 35% 탄산나트륨 1 mL를 반드시 순서대로 가하여 혼합한다.

4.3.4 암소에서 1시간 방치 후 760 nm에서 흡광도를 측정한다.

5. (생  략)

5.1 결과 분석(예)

5.1.1 -------------------- 각 농도별 각 공시험의 흡광도--------------------- ------.

5.1.2 --------------------- --------- 검량선에 적용시킨다.

총 폴리페놀의 함량(탄닌산으로서)(mg/g) = [eqn: {A` TIMES `B` TIMES `C} over {D}]

A: 시험용액 전량(mL)

B: 희석배수

C: 시험용액 중의 총 폴리페놀 농도(mg/mL)

D: 시료 채취량(g 또는 mL)

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3-64 총 폴리페놀

1. (현행과 같음)

-------------------------- --------------------------- -------------------------파장 760 nm에서 측정한 후, 비타민 C 함량을 제외한 값으로 정량 분석한다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 -------(50 mL)

2.1.2 (현행과 같음)

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 초음파 진탕기

2.2 (현행과 같음)

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.2 (현행과 같음)

3.2.1 (현행과 같음)

<삭  제>

3.3 시약-----

4. (현행과 같음)

4.1 (현행과 같음)

4.1.1 --------- 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 증류수를 가하여 정용한다.

4.1.2 ---------------- 적절히 희석하여------------- ----.

4.2 (현행과 같음)

4.2.1 탄닌산으로 5∼10 mg에 상당한 양을 취하여 50 mL 부피플라스에 취한 후 증류수를 소량 가한다.

4.2.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.2.3 위의 용액을 증류수로 50 mL 정용한 후 적절히 희석하여 시험용액으로 한다.

4.2.4 증류수 7.5 mL를 시험관에 각각 취한다.

4.2.5 4.2.4의 시험관에 각각 표준용액, 시험용액 및 증류수(공시험용)를 1 mL씩 취한다.

4.2.6 4.2.5의 각 시험관에 Folin-Denis 시약 0.5 mL을 가한 후 35% 탄산나트륨 1 mL를 넣어 혼합한다.

4.2.7 암소에서 30분 방치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

5. (현행과 같음)

5.1 결과 분석

5.1.1 --------------------   공시험의 흡광도---------- --------------------------.

5.1.2 -------------------- -------- 이용하여 정량한다.

<삭  제>

5.1.3 비타민 C가 총 폴리페놀 함량에 간섭하는 양을 보정하기 위해 시료 중 비타민C의 함량을 「건강기능식품의 기준 및 규격」 중 제 4. 건강기능식품시험법 3-14 비타민 C(제3법)에 따라 미리 분석한다.

5.2 비타민 C 간섭보정계수 설정

5.2.1 시료 중 비타민 C가 총 폴리페놀 함량에 간섭하는 양을 보정하기 위해 순수한 비타민 C를 일정량(mg)(5.1.3에서 분석한 값과 근접한 값) 취한다.

5.2.2 4.2.1에서 4.2.7까지의 과정을 동일하게 수행한다.

5.2.3 흡광도로 측정한 비타민C의 실험값을 이론값으로 나누어 비타민C 간섭보정계수를 설정한다.

5.3 계산

5.3.1 총 폴리페놀의 함량(탄닌산으로서)(mg/g) = [C × (a×b)/S] - (D × E/F)

C: 시험용액 중의 탄닌산의 농도(mg/mL)

a: 시험용액 전량(mL)

b: 희석배수

S: 시료무게(g)

D: 5.1.3에서 측정한 비타민 C의 함량(mg/g)

E: 5.2.2에 따라 흡광도법으로 측정한 비타민 C의 함량(mg/g)

F: 5.2.1에서 취한 순수한 비타민 C의 함량(mg/g)

* [eqn: {E} over {F}] = 비타민 C 간섭 보정계수

3-65 ～ 3-66(생  략)

3-65 ～ 3-66(현행과 같음)

3-67 깅콜릭산(Ginkgolic acid)

1. (생  략)
------------------------- -------------------------- --------------------------------------------------- -------------------------이용하여 분석하는 방법으로 최대흡수파장인 210 nm에서 정량분석한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 ------(10 mL)

2.1.2 ∼ 2.1.8 (생  략)

2.2 (생  략)

2.2.1 고속액체크로마토그래피

2.2.2 자외부흡광광도 검출기(UV Detector) 또는 포토다이오드어레이

검출기(Photodiode Array Detector)

2.2.3 스위칭밸브

2.2.4 C8 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 5 μm, 전처리 컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.5 C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm, 분석컬럼) 또는 이와 동등한 것

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 (생  략)

--- : -------------------

--- : -------------------

<Ginkgolic acid C15:1>

3.1.2 (생  략)

--- : -------------------

--- : -------------------

<Ginkgolic acid C17:1>

3.1.3 (생  략)

--- : -------------------

--- : -------------------

<Ginkgolic acid C13:0>

4. (생  략)

4.1 (생  략)

4.1.1 --------------- 10 mg을 ------------------- 10 mL ------------------- 메탄올 10 mL에 ----.

4.1.2 ------- 10 mg-------- ---- 10 mL -------------- 메탄올 10 mL에 용해한다.

4.1.3 ---------- 10 mg------ ------ 10 mL ------------- ---- 메탄올 10 mL에 용해한다.

4.1.4. (생  략)

4.2 (생  략)

5. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. 고속액체크로마토그래피 조건(예)

항목	조건
---	50 μL
---	210 nm
----	40℃
이동상	---- : ---------------------- ---- : ---------------------- <신 설>
---	---
-----	----

3-67 깅콜릭산(Ginkgolic acid)

1. (현행과 같음)
------------------------- ------------------------- -------------------------- ---------------------------------------------------(최대흡수파장 210 nm) 또는 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석하는 방법이다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 ------(50 mL)

2.1.2 ∼ 2.1.8 (현행과 같음)

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도 검출기 또는 포토다이오드어레이 검출기

2.2.1.3 스위칭밸브

2.2.1.4 C8 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 150 mm, 충진입자크기 5 μm, 전처리 컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.1.5 C18 컬럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충진입자크기 5 μm, 분석컬럼) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(C18, 안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전입자크기 1.7 μm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.1.1 (현행과 같음)

--- : -------------------

--- : -------------------

<삭  제>

3.1.2 (현행과 같음)

--- : -------------------

--- : -------------------

<삭  제>

3.1.3 (생  략)

--- : -------------------

--- : -------------------

<삭  제>

4. (현행과 같음)

4.1 (생  략)

4.1.1 --------------50 mg을 ---------------- 50 mL ----------------- 메탄올로 ----.

4.1.2 ------- 50 mg-------- 50 mL ----------------  메탄올로 ----.

4.1.3 --------- 50 mg------- ------ 50 mL ----------- ---- 메탄올로 ----.

4.1.4. (현행과 같음)

4.2 (현행과 같음)

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목

조건

---

---

-----

---

---

---

이동상

----- : ---------------------

----- : ---------------------

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	30	70
4	30	70
30	5	95
32	5	95
32.1	30	70
40	30	70

---

---

----

---

표 2. 이동상 조건(분석컬럼)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	30	70
4	30	70
30	5	95
32	5	95
32.1	30	70
40	30	70

<신 설>

5.2 (생  략)

깅콜릭산 (ginkgolic acid C13:0, C15:1, C17:1) 함량(mg/kg)	=	A × B × C
		D × 100

A : 시험용액 농도 (μg/mL)

B : 용액량 (mL)

C : 표준품 순도 (%)

D : 시료채취량 (g)

표 2. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목

조건

주입량

2 μL

유속

0.53 mL/분

칼럼온도

40℃

이동상

A - 0.1% 개미산용액

B - 100 %아세토니트릴

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	30	70
0.33	30	70
5.43	20	80
8.26	20	80
8.32	30	70
10	30	70

이온화

ESI, Negative

Capillary Voltage

3.5 kV

Source Temp.

150℃

Desolvation Temp.

200℃

표 3. 질량검출기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)	Cone(V)
Gingkolic Acid C13:0	319	119, 133, 275	25
Gingkolic Acid C15:1	345	119, 133, 301	25
Gingkolic Acid C17:1	373	119, 133, 329	30

5.2 (현행과 같음)

깅콜릭산(Ginkgolic acid C13:0, C15:1, C17:1) 함량(mg/kg) = C × (a × b)/S

C : 시험용액 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료채취량(g)

3-68～3-73 (생  략)

3-68～3-73 (현행과 같음)

3-74 히알루론산

1. (생  략)

2. (생  략)

2.1 ∼ 2.2 (생  략)

2.3 분석장비의 준비

3. (생  략)

3.1 ∼ 3.2 (생  략)

3.3 --- 제조

3.3.1 (생  략)

-----------------------  ---------------------------------------------------------------pH 8.0으로 ------------------.

4. (생  략)

4.1 ---- 제조

4.1.1 ∼ 4.1.2 (생  략)

4.1.3 -------------------- --------------------- ---------------- 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 ------------------------- -----.

4.1.4 (생  략)

4.2 ---- 제조

4.2.1 ∼ 4.2.2 (생  략)

4.2.3 --------------------- --------------------- ---------------- 33 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액 -----------------------------.

4.2.4. (생  략)

5.1 (생  략)

표 1. (생  략)

항목	조건
---	----L
----	---
---	0.05 M NaCl(pH 3.5)
-----	----
---	-------

5.2 (생  략)

5.2.1. 히알루론산 표준용액에서 얻은 히알루론산의 피크면적으로 검량선을 작성하고, 검량선 식을 이용하여 시험용액 중의 히알루론산의 농도를 구한 후 아래 식을 이용하여 히알루론산 함량을 계산한다.

히알루론산의 함량 (mg/g)	=	A× B×C	×	378.3
		D×1,000		401.3

A : 시험용액의 전량(mL)

B : 희석배수

C : 시험용액중의 히알루론산의 농도(μg/mL)

D : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

378.3 : 히알루론산 이당류의 분자량

401.3 : 히알루론산 나트륨 이당류의 분자량

3-74 히알루론산

1. (현행과 같음)

2. (현행과 같음)

2.1 ∼ 2.2 (현행과 같음)

<삭  제>

3. (현행과 같음)

3.1 ∼ 3.2 (현행과 같음)

3.3 --- 조제

3.3.1 (현행과 같음)

트리스염 3.99 g과 아세트산나---------------------- ---------------------- -------------- pH 6.8으로 ------------------.

4. (현행과 같음)

4.1 ---- 조제

4.1.1 ∼ 4.1.2 (현행과 같음)

4.1.3 -------------------- ---------------------- ---------------- 33 mM Tris-HCl(pH 6.8) 완충용액 ------------------------- -----.

4.1.4 (현행과 같음)

4.2 ---- 조제

4.2.1 ∼ 4.2.2 (현행과 같음)

4.2.3 --------------------- --------------------- ---------------- 33 mM Tris-HCl(pH 6.8) 완충용액 ------------------------------.

4.2.4. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

표 1. (현행과 같음)

항목	조건
---	---
----	---
---	0.01 M NaCl(pH 3.5)
-----	----
---	----

5.2 (현행과 같음)

5.2.1. <삭  제>

히알루론산의 함량(mg/g)

= C × (a × b)/S × 1/1,000 × 378.3/401.3

C : 시험용액중의 히알루론산의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료 채취량(g)

1/1,000 : 단위 환산 계수

378.3 : 히알루론산 이당류의

분자량

401.3 : 히알루론산 나트륨 이당류의 분자량

3-79 알파에스1카제인(αs1-casein)(f91-100)

1. (생  략)

------ 시료로부터 알파에스1카제인(f91-100)을 고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 자외부흡광광도검출기를 이용하여 분석한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 (생  략)

2.1.2 HPLC 유리병

2.1.3 용매용 일회용 실린지

2.1.4 여과용 멤브레인 필터(PTFE, 0.45 mm)

2.1.5 교반기

2.2 (생  략)

2.2.1 고속액체크로마토그래프

<신  설>

<신  설>

<신  설>

2.2.2 자외부 흡광 광도 검출기(UV Detector)

<신  설>

<신  설>

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 Decapeptide(Synthetic αS1-Casein)(f91-100)

분자식 : C60H94N14O16, 분자량 : 1267.50

3.2 (생  략)

3.2.1 (생  략)

3.2.2 증류수

3.2.3 (생  략)

4. (생  략)

4.1 ----- 제조

4.1.1 Synthethic 알파에스카제인(αS1 -Casein)(f91-100) 표준물질을 5 mg ∼100 mg을 정밀히 측정하여 10 mL 부피플라스크에 넣는다.

4.1.2 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 완전히 녹인 후 이를 표준원액으로 한다.

4.1.3 위의 용액을 적절히 단계별로 희석하여 표준용액으로 한다.

4.1.4 30 분간 교반한 후 표준원액을 적절히 희석(예; 1:20)하여 검량선 작성용 표준용액을 조제한다.

4.1.5 0.45 mm 멤브레인 필터로 여과한 것을 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액 제조

4.2.1 원료 약 20 mg (±0.1 mg)을 50 mL의 용기에 취하여 이동상 A, B가 혼합된 용액 (74:26 (v:v))으로 녹인다.

4.2.2 유단백가수분해물로서 2 mg/mL의 농도가 되도록 한다.

4.2.3 30 분간 교반한 후 0.45 mm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

<신  설>

5. (생  략)

5.1 (생  략)

5.1.1 고속액체크로마토그래프(예)

표 1. (생  략)

항목	조건
----	100 μL
----	----
---	A용액 : 0.1% 트리플루오르아세트산 수용액 B용액 : 0.1% 삼불화초산이 첨가된 아세토니트릴
----	280 ㎚
---	----

표 2. 이동상 조건(예)

시간(분)	이 동 상 (%)
	A 용액	B 용액
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-

<신  설>

<신  설>

<신  설>

5.2 (생  략)

알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 함량(mg/g) = [eqn: A` TIMES `B`` TIMES `C``/`S]

A : 시험용액중의 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 농도(mg/mL)

B : 시험용액 전량(mL)

C : 표준품 순도

S : 시료채취량(g)

3-79 알파에스1카제인(αs1-casein)(f91-100)

1. (현행과 같음)

-------- 시료 중 알파에스1카제인(f91-100)을 이동상으로 용해한 후 초음파 추출하여 최대흡수파장인 276 nm에서 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정량 분석한다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 (현행과 같음)

2.1.2 용매용 일회용 실린지

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 초음파진탕기

<삭  제>

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

2.2.1.1 고속액체크로마토그래프

2.2.1.2 자외부흡광광도검출기(UV Detector)

2.2.1.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것

2.2.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

2.2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2.2 질량검출기(Mass Selective Detector)

2.2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충전제 Octadecyl silica, 충전입자크기 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.1.1 알파에스1카제인(αS1-Casein)(f91-100)

분자식 : C60H94N14O16, 분자량 : 1267.50
Tyr1-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-Gln-Leu-Leu-Arg10

3.2 (현행과 같음)

3.2.1 (현행과 같음)

3.2.2 개미산(Formic acid)

3.2.3 (현행과 동일)

4. (현행과 같음)

4.1 ------ 조제

4.1.1 알파에스1카제인 표준물질 10 mg을 정밀하게 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 추출용매로 정용한 후 표준용액으로 한다.

4.1.2 표준원액을 추출용매로 적절히 희석하여 표준용액으로 사용한다.

<삭  제>

<삭  제>

<삭  제>

4.2 추출용매의 조제

4.2.1 0.1% 트리플로우로아세트산이 첨가된 증류수와 0.1% 트리풀루오르아세트산이 첨가된 아세토니트릴을 74 : 26 (v:v)의 비율로 잘 혼합하여 사용한다.

<삭  제>

<삭  제>

4.3 시험용액의 조제

4.3.1 알파에스1카제인으로 1.0∼1.5 mg에 상당하는 양을 취하여 50 mL 부피플라스크에 취한 후 추출용매를 넣어 시료를 녹인다.

4.3.2 30분 동안 초음파 추출한다.

4.3.3 위의 용액을 추출용매로 50 mL로 정용하고 추출용매로 적절히 희석한 후 0.45 mm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4.3.4 시험용액을 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 또는 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기로 분석하여 알파에스1카제인 함량을 구한다.

5. (현행과 같음)

5.1 (현행과 같음)

5.1.1 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기

표 1. (현행과 같음)

항목	조건
----	20 μL
---	-
---	A: 0.1% 트리플루오르아세트산용액 B: 0.1% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴
----	276 ㎚
---	----

표 2. 고속액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-
-	-	-

5.1.2 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기

표 3. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A: 0.1% 개미산, 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유한 증류수 B: 0.1% 개미산, 0.01% 트리플루오르아세트산을 함유한 아세토니트릴
칼럼온도	40℃
유속	0.5 mL/분
주입량	5 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary voltage	2.0 kV
Cone voltage	30 V
Desolvation temperature	350℃
Monitor ions(m/z)	1268(precursor ion), 771, 658(product ion)

표 4. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 이동상 조건(예)

시간(분)	이동상(%)
	A	B
0	85	15
1	85	15
11	30	70
12	30	70
12.5	0	100
14	0	100
15.5	85	15
17	85	15

5.2 (현행과 같음)

5.2.1 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 함량(mg/g) = C × (a×b)/S

C : 시험용액 중의 알파에스1카제인(αS1-casein)(f91-100)의 농도(mg/mL)

a : 시험용액 전량(mL)

b : 희석배수

S : 시료무게(g)

3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

1. (생  략)

------시료로부터 추출한 글루코실세라미드(Glucosylceramide)를 고속액체크로마토그래프 분석하는 방법으로 ELSD(Evaporative Light Scattering Detector) 검출기를 이용하여  정성 및 정량분석을 한다.

2. (생  략)

2.1 (생  략)

2.1.1 -------(10 mL)

2.1.2 삼각플라스크(100 mL)

2.1.3 분액여두(200 mL)

2.1.4 0.45 μm 멤브레인 필터

<신  설>

<신  설>

2.2 (생  략)

2.2.1 고속액체크로마토그래프

2.2.2 Inertsil 100A (3.0×150mm, 5um, GL science) 또는 이와 동등한 것

2.2.3 증기화 광산란 검출기(ELSD, Evaporative Light Scattering Detector)

3. (생  략)

3.1 (생  략)

3.1.1 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

3.2 (생  략)

3.2.1 ∼ 3.2.3 (생  략)

3.2.4 증류수

4. (생  략)

4.1 표준용액

4.1.1 10 mL 용량플라스크에 글루코실세라미드 표준물질 10mg을 정밀하게 달아 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액 일정량을 넣어 초음파  처리하여 방냉 후 정용한 것(1.0 mg/mL)을 표준원액이라 한다.  표준원액을 적절히 희석하여 0.1, 검량선 작성용 표준 용액을 조제한다.

<신  설>

4.2 시험용액

4.2.1 100 mL 삼각플라스크에 시료 약 1 g을 취한 후 0.4 N 메탄올성 KOH 용액 50 mL을 첨가하여 상온에서 2시간 교반하여 알칼리 처리를 한다.

4.2.2 200 mL 분액여두에 알칼리 처리액을 옮긴 후 증류수 40 mL로 삼각 플라스크를 세척하여 분액여두에 옮긴 후 다시 클로로포름 45 mL로 삼각플라스크를 세척하여 분액여두로 옮긴다.

4.2.3 분액여두를 약 10분간 진탕한 후 정치시켜 층을 분리시킨 후 클로로포름층을 취한다.

4.2.4 위 클로로포름 추출과정을 2회 반복하여 회수된 클로로포름층을 합한다.

4.2.5 클로로포름을 감압 농축을 통하여 농축한다.

4.2.6 농축된 잔류물을 클로로포름:메탄올=9:1 혼합액에 용해시켜     20 mL로 정용한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

5. (생  략)

표 1. 고속액체크로마토그래프 조건(예)

항목	조건
시료 주입량	10 μL
가스 유량	2 L/min
칼럼 온도	37℃
이동상	A 용액 - 클로로포름 B 용액 - 클로로포름:메탄올=1:1 혼합액
유속	0.6 mL/min
검출기 drift tube 온도	70℃

5.1 기기분석

표 2. 이동상 조건

시간(분)	A 용액(%)	B 용액(%)
0	99	1
5	97	3
10	35	65
22	1	99
27	99	1

<신  설>

5.2 계산

5.2.1 표준용액 및 시험용액 동일한 양을 주입하여 앞의 시험조작에 따라 시험하여 다음과 같이 글루코실세라미드 함량을 구한다.

글루코실세라미드 함량 (mg/g)	=

시험용액의 농도 (mg/mL)	×	시험용액의 전량 (mL)	×	1,000
		시료채취량 (mg)

3-81 글루코실세라미드(Glucosylceramide)

1. (현행과 같음)

----- 메탄올성 수산화칼륨 용액을 처리한 후 클로로포름으로 글루코실세라미드를 추출하고 액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기를 이용하여 정성 및 정량 분석하는 방법이다.

2. (현행과 같음)

2.1 (현행과 같음)

2.1.1 -------(10 mL 및 100 mL)

2.1.2 용매용 일회용 실린지

2.1.3 여과용 멤브레인 필터

2.1.4 액체크로마토그래프용 유리병

2.1.5 환저플라스크(250 mL)

2.1.6 회전진공증발농축기

2.2 (현행과 같음)

2.2.1 액체크로마토그래프

2.2.2 질량검출기

2.2.3 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 2.1 mm, 길이 100 mm, 충진입자크기 1.7 μm, octadecyl silica) 또는 이와 동등한 것

3. (현행과 같음)

3.1 (현행과 같음)

3.1.1 곤약 글루코실세라미드(Konjac glucosylceramide, Funakoshi, NS170302 또는 NS170303)

분자식: C42H79NO9, 분자량: 742.08, CAS No.: 58173-44

3.2 (현행과 같음)

3.2.1 ∼ 3.2.3 (생  략)

<삭  제>

4. (현행과 같음)

4.1 표준용액의 조제

4.1.1 표준물질 글루코실세라마이드 50 mg을 50 mL 부피플라스크에 넣고 소량의 메탄올로 완전히 녹인 후 정용하여 표준원액으로 한다.

4.1.2 위의 표준원액을 메탄올로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

4.2 시험용액의 조제

4.2.1 글루코실세라미드로서 약 2.4 mg에 해당하는 시료를 100 mL 비이커에 넣고 0.4 N 메탄올성 수산화칼륨 용액 50 mL을 가한 후 2시간 동안 교반한다.

4.2.2 위액을 250 mL 분액여두로 옮기고 증류수 40 mL을 이용하여 비커를 씻어 분액여두에 합친다.

4.2.3 분액여두에 클로로포름 45 mL을 가하여 진탕 혼합하고 층 분리가 충분히 되도록 방치 한 후 클로로포름층을 환저플라스크로 옮긴다. 이 과정을 2회 더 반복한다.

4.2.4 환저플라스크로 옮긴 클로로포름층을 60℃에서 감압농축한 후 소량의 메탄올에 녹여 20 mL 부피플라스크에 옮긴 후 메탄올로 정용한다.

4.2.5 위의 시험용액을 메탄올로 적절히 희석한 후 0.2 μm  멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

<삭  제>

5. (현행과 같음)

5.1 기기분석

표 1. 고속액체크로마토그래프/질량검출기/질량검출기 조건(예)

항목	조건
이동상	A용액 : 0.1% 개미산 B용액 : 0.1% 개미산 함유 메탄올
칼럼온도	40℃
유속	0.35 mL/min
주입량	1 μL
이온화	ESI, Positive
Capillary Voltage	2.5 kV
Source Temp.	150℃
Desolvation temperature	350℃

표 2. 질량검출기 분석을 위한 이온

성분	Precursor ion(m/z)	Product ion(m/z)	Cone(V)
글루코실세라미드	743	262	20

표 3. 이동상 조건(예)

시간(분)	A용액(%)	B용액(%)
0	5	95
1.5	5	95
2.0	0	100
5.0	0	100
5.1	5	95
10	5	95

5.2 계산

5.2.1 글루코실세라미드(mg/g)

= C × (a × b)/S × 1/1,000

C : 시험용액 중 글루코실세라마이드의 농도(μg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 희석배수

S: 시료 채취량(g)

1/1,000: 단위 환산 계수

<별첨 1>                                          [별표 3] 한국인 영양섭취기준(현행)

연 령	탄수화물 (g)		지방 (g)		n-6불포화지방산(g)		n-3불포화지방산(g)		단백질 (g)		식이섬유 (g)		수분 (ml)		비타민C (mg)		티아민 (mg)		리보플라민 (mg)		니아신 (mg NE		비타민B6 (mg)		엽산 (μg DFE)		비타민B12 (μg)		판토텐산 (mg)		비오틴 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		55 90		25 25		2.0 4.5		0.3 0.8	13.5	9.5				700 800		35 45		0.2 0.3		0.3 0.4		2 3		0.1 0.3		65 80		0.3 0.5		1.7 1.8		5 7
소아 1～2(세) 3～5									15 20			10 15		1,100 1,400	40 40		0.5 0.5		0.6 0.7		6 7		0.6 0.7		150 180		0.9 1.1			2 3		9 11
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상									25 35 50 55 55 55 50 50 50			20 20 25 25 25 25 25 25 25		1,800 2,000 2,300 2,600 2,600 2,500 2,200 2,100 2,100	60 70 100 110 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		0.9 1.1 1.5 1.7 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		9 11 15 17 16 16 16 16 16		0.9 1.1 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		220 300 400 400 400 400 400 400 400		1.3 1.7 2.3 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4			3 4 5 6 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상									25 35 45 45 50 45 45 45 45			15 15 20 20 20 20 20 20 20		1,700 1,800 2,000 2,100 2,100 2,000 1,900 1,800 1,800	60 80 100 100 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.0 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1		0.7 0.9 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		9 11 14 14 14 14 14 14 14		0.9 1.1 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4		220 300 400 400 400 400 400 400 400		1.5 1.9 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4			3 4 5 6 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30
임신부									+30			+5		+200	+10		+0.4		+0.4		+4		+0.8		+200		+0.2			+1		+0
수유부									+25			+5		+700	+35		+0.4		+0.4		+5		+0.8		+150		+0.4			+2		+5

[사단법인 한국영양학회 : 한국인 영양섭취기준 (2010년)

연 령	비타민A (μg RE)		비타민D (μg)		비타민E (mg α-TE)		비타민K (μg)		칼슘 (mg)		인 (mg)		나트륨 (g)		염소 (g)		칼륨 (g)		마그네슘 (mg)		철 (mg)		아연 (mg)		구리 (μg)		불소 (mg)		망간 (mg)		요오드 (μg)		셀레늄 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		300 400		5 5		3 4		4 7		200 300		100 300		0.12 0.37		0.18 0.56		0.4 0.7		30 55	6	0.3	2.8	1.7		230 300		0.01 0.5		0.01 0.8		130 170		8.5 11
소아 1～2(세) 3～5	300 300			5 5		5 6		25 30	500 600		500 500			0.7 0.9		1.1 1.4		1.7 2.3	75 100		6 7		3 4		290 330			0.6 0.8		1.4 2.0	80 90		20 25
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상	400 550 700 850 750 750 700 700 700			5 5 5 5 5 5 10 10 10		8 9 10 12 12 12 12 12 12		45 55 70 80 75 75 75 75 75	700 800 1,000 900 750 750 700 700 700		700 1,000 1,000 1,000 700 700 700 700 700			1.2 1.3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.4 1.2 1.1		1.8 2.0 2.3 2.3 2.3 2.3 2.1 1.9 1.6		2.8 3.2 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	150 210 300 400 340 350 350 350 350		8 11 14 15 10 10 9 9 9		5 8 8 10 10 9 9 9 9		430 570 740 870 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 3.0 3.0 3.0 3.0		2.5 3.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.04.0 4.0	100 110 130 130 150 150 150 150 150		30 40 50 60 55 55 55 55 55
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상	400 500 650 600 650 650 600 600 600			5 5 5 5 5 5 10 10 10		7 8 9 10 10 10 10 10 10		45 55 65 65 65 65 65 65 65	700 800 900 800 650650 700 700 700		600 900 900 800 700 700 700 700 700			1.2 1.3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.4 1.2 1.1		1.8 2.0 2.3 2.3 2.3 2.3 2.1 1.9 1.6		2.8 3.2 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	150 210 290 340 280 280 280 280 280		8 10 13 17 14 14 8 8 8		5 7 7 9 8 8 8 7 7		430 570 740 870 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5		2.5 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	100 110 130 130 150 150 150 150 150		30 40 50 60 55 55 55 55 55
임신부	+70			+5		+0		+0	+280		+0			+0		+0		+0	+40		+10		+2.5		+130			+0		+0	+90		+4
수유부	+490			+5		+3		+0	+370		+0			+0		+0		+0.4	+0		+0		+5.0		+450			+0		+0	+180		+10

* 권장섭취량 : 1일 연령별로 권장되는 영양소 섭취량으로서 평균 필요량을 근거로 하여 산출

* 충분섭취량 : 권장섭취량을 산출할 수 없는 경우 역학조사 결과를 토대로 건강인의 영양소 섭취수준을 기준으로 산출

<별첨 1>                           [별표 3] 한국인 영양섭취기준(개정안)

연 령	탄수화물 (g)		지방 (g)		n-6계 지방산 (g)		n-3계 지방산 (g)		단백질 (g)		수분(mL)		식이섬유 (g)			비타민A (μg RE)			비타민D (μg)		비타민E (mg α-TE)		비타민K (μg)		비타민C (mg)		티아민 (mg)		리보플라민 (mg)		니아신 (mg NE)		비타민B6 (mg)		엽산 (μg DFE)		비타민B12 (㎍)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량 (총수분)		권장 섭취량	충분 섭취량		권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		60 90		25 25		2.0 4.5		0.3 0.8	15	9.5		700 800						350 450		5 5		3 4		4 7		35 45		0.2 0.3		0.3 0.4		2 3		0.1 0.3		65 80		0.3 0.5
유아 1～2(세) 3～5									15 20			1,100 1,500			10 15		300 350			5 5		5 6		25 30	35 40		0.5 0.5		0.5 0.6		6 7		0.6 0.7		150 180		0.9 1.1
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상									30 40 55 65 65 60 60 55 55			1,800 2,100 2,300 2,600 2,600 2,500 2,200 2,100 2,100			20 20 25 25 25 25 25 25 25		450 600 750 850 800 750 750 700 700			5 5 10 10 10 10 10 15 15		7 9 10 11 12 12 12 12 12		45 55 70 80 75 75 75 75 75	55 70 90 105 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		0.9 1.2 1.5 1.7 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		9 12 15 17 16 16 16 16 16		0.9 1.1 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.7 2.3 2.7 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상									25 40 50 50 55 50 50 45 45			1,700 1,900 2,000 2,000 2,100 2,000 1,900 1,800 1,800			20 20 20 20 20 20 20 20 20		400 550 650 600 650 650 600 550 550			5 5 10 10 10 10 10 15 15		7 9 10 11 12 12 12 12 12		45 55 65 65 65 65 65 65 65	60 80 100 95 100 100 100 100 100		0.7 0.9 1.1 1.2 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1		0.8 1.0 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2		9 12 15 14 14 14 14 14 14		0.9 1.1 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4		220 300 360 400 400 400 400 400 400		1.3 1.7 2.3 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4 2.4
임신부									+15/+30			+200			+5		+70			+0		+0		+0	+10		+0.4		+0.4		+4		+0.8		+220		+0.2
수유부									+25			+700			+5		+490			+0		+3		+0	+40		+0.4		+0.5		+3		+0.8		+150		+0.4

〔사단법인〕 보건복지부, 한국영양학회 : 한국인 영양소 섭취기준 (2015)

연 령	판토텐산 (mg)		비오틴 (μg)		칼슘 (mg)		인 (mg)		나트륨 (g)		염소 (g)		칼륨 (g)		마그네슘 (mg)		철 (mg)		아연 (mg)		구리 (μg)		불소 (mg)		망간 (mg)		요오드 (μg)		셀레늄 (μg)		몰리브덴 (μg)		크롬 (μg)
	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량	권장 섭취량	충분 섭취량
영아 0～5(개월) 6～11		1.7 1.9		5 7		210 300		100 300		0.12 0.37		0.18 0.56		0.4 0.7		30 55	6	0.3	3	2		240 310		0.01 0.5		0.01 0.8		130 170		9 11				0.2 5.0
유아 1～2(세) 3～5		2 2		9 11	500 600		450 550			0.9 1.0		1.3 1.5		2.0 2.3	80 100		6 6		3 4		280 320			0.6 0.8		1.5 2.0	80 90		23 25					12 12
남자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75 이상		3 4 5 5 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30	700 800 1,000 900 800 800 750 700 700		600 1,200 1,200 1,200 700 700 700 700 700			1.2 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.1		1.9 2.1 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.7		2.6 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	160 230 320 400 350 370 370 370 370		9 10 14 14 10 10 10 9 9		6 8 8 10 10 10 9 9 9		440 580 740 840 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 3.0 3.5 3.0 3.0 3.0 3.0		2.5 3.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0	100 110 130 130 150 150 150 150 150		35 45 60 65 60 60 60 60 60		30 25 25 25 25			20 25 35 40 35 35 35 35 35
여자 6～8(세) 9～11 12～14 15～18 19～29 30～49 50～64 65～74 75이상		3 4 5 5 5 5 5 5 5		15 20 25 30 30 30 30 30 30	700 800 900 800 700 700 800 800 800		550 1,200 1,200 1,200 700 700 700 700 700			1.2 1.4 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.3 1.1		1.9 2.1 2.3 2.3 2.3 2.3 2.3 2.0 1.7		2.6 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	150 210 290 340 280 280 280 280 280		8 10 16 14 14 14 8 8 7		5 8 8 9 8 8 7 7 7		440 580 740 840 800 800 800 800 800			1.0 2.0 2.5 2.5 3.0 2.5 2.5 2.5 2.5		2.5 3.0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5	100 110 130 130 150 150 150 150 150		35 45 60 65 60 60 60 60 60		25 25 25 25 25			15 20 25 25 25 25 25 25 25
임신부		+1		+0	+0		+0			+1.5		+2.3		+0	+40		+10		+2.5		+130			+0		+0	+90		+4					+5
수유부		+2		+5	+0		+0			+1.5		+2.3		+0.4	+0		+0		+5.0		+480			+0		+0	+190		+10					+20

* 권장섭취량 : 1일 연령별로 권장되는 영양소 섭취량으로서 평균 필요량을 근거로 하여 산출

* 충분섭취량 : 권장섭취량을 산출할 수 없는 경우 역학조사 결과를 토대로 건강인의 영양소 섭취수준을 기준으로 산출

* 임신부 단백질 권장섭취량: 임신 2, 3분기별 부가량