식품의약품안전처 공고 제2016 - 777호

「약사법」 제51조제1항에 따른 「대한민국약전」(식품의약품안전처 고시 제2016-57호, 2016. 6. 30.)을 일부개정함에 있어 국민에게 미리 알려 의견을 수렴하고자 그 취지, 개정 이유 및 주요 내용을 「행정절차법」 제46조에 따라 다음과 같이 공고합니다.

2016년 12월 22일

식품의약품안전처장

대한민국약전 일부개정고시(안) 행정예고

1. 개정 이유

시험자 안전과 환경보호를 위한 유해시약 대체시험법 및 항생제 정량법의 편의성․정확성을 높이기 위한 시험법을 제공하고 바이오의약품 품질관리를 위한 시험법을 신설하는 등 「대한민국약전」 시험법의 안전성․정확성․편의성 등을 개선하여 의약품 제조․품질관리 현장의 활용도를 제고하려는 것임

2. 주요 내용

가. ‘데소니드’ 등에 대하여 전처리 방법, 검액 및 표준액 농도, 조작조건 개선 등을 개선하여 시험법의 정확성 및 편의성 등을 제고함

나. ‘살리실산글리콜’ 등에 대하여 시험자 안전 및 환경오염 방지를 위한 클로로포름 등 유해시약 대체시험법을 제공함

다. ‘바캄피실린염산염 과립’ 등 항생제 정량법에 HPLC를 사용하는 시험법을 제공하는 등 정확성 및 편의성을 개선함

라. 일반시험법에 바이오의약품 품질관리를 위한 시험법 및 잔류용매 동시분석법을 신설함

3. 의견제출

「대한민국약전」 일부개정고시(안)에 대하여 의견이 있는 단체 또는 개인은 2017년 2월 20일까지 다음 사항을 기재한 의견서를 식품의약품안전처장(우편번호: 28159, 주소 : 충청북도 청주시 흥덕구 오송읍 오송생명2로 187 식품의약품안전처, 참조 : 의약품정책과 전화 043-719-2688, 팩스 043-719-2606)에게 제출하여 주시기 바랍니다.

가. 예고사항에 대한 의견(찬, 반 여부와 그 사유)

나. 성명(단체인 경우 단체명과 그 대표자 성명), 주소 및 전화번호

다. 기타 참고사항

식품의약품안전처 고시 제2017 - 호

「약사법」 제51조제1항에 따른 「대한민국약전」(식품의약품안전처고시 제2016-57호, 2016. 6. 30.)을 다음과 같이 개정 고시합니다.

2017년  월  일

식품의약품안전처장

대한민국약전 일부개정고시(안)

대한민국약전 [별표 3] 의약품각조 제1부 일부를 다음과 같이 개정한다.

결정글루코사민황산염의 확인시험 용액 (I) 중 “100 g”을 “100 mg”으로 한다.

글루타민의 확인시험 7) 유연물질 중 “0.5 %”를 “0.2 %”으로 한다.

L-글루탐산나트륨수화물의 정량법 수식 중 “16.911”을 “8.455”로 한다.

데소니드의 흡광도 중 “30”을 “15”로, “200”을 “1000”으로 한다.

디아세레인의 확인시험 3) 중 “10000”을 “100000”으로, “파장 255 nm”를 “파장 217 nm, 255 nm”로 한다.

레바미피드의 정량법 중 “미황색이 무색”을 “액의 엷은 노란색이 엷은 보라색”으로 한다.

로얄젤리·히드로코르티손 크림 정량법 1)을 다음과 같이 한다.

정 량 법  1) 로얄젤리 중 10-히드록시-2-데세노인산  이 약의 10-히드록시-2-데세노인산으로서 약 5 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 메탄올 40 mL를 넣어 20 분간 초음파 처리하고, 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL 로 한다. 이 액을 원심분리 하여 위의 맑은 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 5 mg 을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 정확하게 50 mL로 한다. 이 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

10-히드록시-2-데세노인산(C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 214 nm)

이동상 : 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)․메탄올혼합액 (1：1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 :　표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 10-히드록시-2-데세노인산 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)  인산이수소칼륨 0.170 g을 물 980 mL에 녹이고 인산을 넣어 pH 3.0으로 조정한 다음 물을 넣어 1000 mL로 한다.

메틸페니데이트염산염의 순도시험 1) 중 “메틸페니데이트염산염에리트로이성질체표준품”을 “메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품”으로 하고 정량법 조작조건 이동상 중 “2.7 g/L 인산이수소칼륨아세트산암모늄 수용액”을 “0.02 mol/L 인산이수소칼륨시액”으로 하며 시스템적합성 시스템의 성능 중 “에리트로이성질체표준품”을 “메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품”으로 한다.

l-무스콘의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 l-무스콘표준품 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 3 μL씩을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 l-무스콘의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

l-무스콘(C16H30O)의 양 (mg)

= l-무스콘표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦ 내부표준액 : 시클로펜타데카논의 클로로포름용액(1 → 500)

조작조건

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 약 0.32 mm, 길이 약 30 m인 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용디메틸폴리실록산을 0.25 μm의 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 180 ℃ 부근의 일정온도

검체도입부 온도 : 250 ℃

검출기 온도 : 260 ℃

운반기체 : 질소

유  량 : 1.0 mL/분

분할비 : 10 : 1

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 3 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질, l-무스콘 순서로 유출하고 분리도는 1.5 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 3 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 내부표준물질에 대한 l-무스콘의 피크면적비의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

미분화에토돌락 정의 제제균일성시험을 “시험할 때 적합하다.”로 한다.

미분화에토돌락 캡슐의 제제균일성시험을 “시험할 때 적합하다.”로 한다.

바캄피실린염산염 과립의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약을 가루로 하여 표시역가에 따라 약 40 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 바캄피실린염산염표준품 약 40 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 바캄피실린의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

암피실린(C16H19N3O4S)의 역가 (μg)

= 바캄피실린염산염표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정 온도

검체도입부 온도 : 4 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소나트륨용액 500 mL에 0.02 mol/L 인산수소나트륨용액을 넣어 pH를 6.8로 조정한다. 이 액 500 mL에 아세토니트릴 500 mL를 넣는다.

유  량 : 1 mL/분

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 20 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 바캄피실린 피크의 이론단수는 3000 단 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 바캄피실린의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

벤포티아민의 확인시험 1) 다음에 시액 조제법을 다음과 같이 신설하고 순도시험 6)의 “5 mg”을 “5 μg”으로 한다.

◦ 시스테인염산염 시액 : L-시스테인염산염 0.7 g에 아세트산ㆍ아세트산나트륨완충액 (pH 5.0) 10 mL을 넣어 녹이고, pH 5.0으로 조정하고 아세트산ㆍ아세트산나트륨완충액 (pH 5.0)을 넣어 20  mL로 한다.

◦ 효소 시액 : 아스페르길루스에서 얻은 전분당화력 및 인산에스테르 분해력이 강한 효소제 1 g에 아세트산․아세트산나트륨완충액(pH 5.0)을 넣어 100 mL로 한다. 쓸 때 조제한다.

복방니코틴산아미드·로얄젤리·리보플라빈 캡슐의 정량법 1) 10-히드록시-2-데세노인산을 다음과 같이 한다.

정 량 법  1) 10-히드록시-2-데세노인산  이 약 20 캡슐 이상을 가지고 그 내용물의 질량을 정밀하게 단다. 10-히드록시-2-데세노인산으로서 약 5 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 메탄올 40 mL를 넣어 20 분간 초음파 처리하고 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로 한다. 이 액을 원심분리하여 위의 맑은 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 5 mg 을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 정확하게 50 mL로 한다. 이 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

10-히드록시-2-데세노인산(C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 214 nm)

이동상 : 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)·메탄올혼합액 (1：1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 :　 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 10-히드록시-2-데세노인산의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)  인산이수소칼륨 0.340 g을 물에 녹여 1000 mL로 하고 인산을 넣어 pH 3.0으로 조정한다.

복방아스코르브산·리소짐염산염·카르바조크롬 캡슐의 정량법 1) 중 “100”을 “200”으로 한다.

브롬헥신염산염 정의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 질량을 정밀하게 달아 가루로 하여 브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl) 약 8 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 80 % 메탄올 40 mL를 넣고 20 분간 세게 흔들어 섞은 다음 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 32 mg을 정밀하게 달아 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 25 mL를 정확하게 취하여 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 브롬헥신염산염의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl )의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × [eqn: {1} over {4}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼 럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소칼륨액 (pH 3.5)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 브롬헥신염산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

브롬헥신염산염 주사액의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 브롬헥신염산염 (C14H20N2Br2·HCl) 8 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 80 % 메탄올 40 mL를 넣고 20 분간 세게 흔들어 섞은 다음 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 32 mg을 정밀하게 달아 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 25 mL를 정확하게 취하여 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 브롬헥신염산염의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl)의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × [eqn: {1} over {4}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼 럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소칼륨액 (pH 3.5)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 브롬헥신염산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

살리실산글리콜의 순도시험 3) 유연물질 중 “1.0 g을 클로로포름”을 “0.1 g을 에탄올”로 하고, “1.0”을 “1”로 하며, “클로로포름으로 50.0”을 “에탄올로 50”으로 하고, “갖고”를 “가지고”로 하며, “아세트산에틸·클로로포름·아세트산(100)혼합액(100 : 100 : 1)”을 “에틸아세테이트·n-헥산혼합액(27 : 20)”으로 한다.

주사용 세프미녹스나트륨의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시역가에 따라 세프미녹스나트륨 약 70 mg (역가)에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 세프미녹스나트륨표준품 약 70 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 세프미녹스의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

세프미녹스(C16H21N7O7S3)의 역가 (μg)

= 세프미녹스나트륨표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES it {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 273 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 완충액·메탄올혼합액 (9 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 세프미녹스의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 완충액  아세트산나트륨삼수화물 2.04 g을 달아 물 750 mL를 넣어 녹이고 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 물을 넣어 정확하게 1000 mL로 한다.

세프미녹스나트륨수화물의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 및 세프미녹스나트륨표준품 약 70 mg (역가) 씩을 정밀하게 달아 각각 물을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액 및 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 세프미녹스의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

세프미녹스(C16H21N7O7S3)의 역가 (μg)

= 세프미녹스나트륨표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES it {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 273 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 완충액·메탄올혼합액 (9 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 세프미녹스의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 완충액  아세트산나트륨삼수화물 2.04 g을 달아 물 750 mL를 넣어 녹이고 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 물을 넣어 정확하게 1000 mL로 한다.

세프프로질 정의 용출시험 중 “0.4 mg”을 “0.3 mg”으로 한다.

셀레늄함유건조효모의 질소 중 “1 g”을 “30 mg”으로 한다.

시네파지드말레산염 정의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 시네파지드말레산염(C22H31N3O5·C4H4O4) 약 50 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 0.05 mol/L 염산을 넣어 녹이고 초음파 처리한 다음 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 4 mL 및 내부표준액 10 mL를 정확하게 취하여 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 시네파지드말레산염표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 4 mL 및 내부표준액 10 mL를 정확하게 취하여 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 시네파지드말레산염의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

시네파지드말레산염 (C22H31N3O5·C4H4O4)의 양 (mg)

= 시네파지드말레산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦ 내부표준액 : 벤조산나트륨의 수용액(1 → 10000)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 220 nm)

칼 럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : 인산염완충액 (pH 2.4)·아세토니트릴혼합액 (4 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 시네파지드말레산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 인산염완충액 (pH 2.4)  인산이수소나트륨이수화물 3.1 g을 물 900 mL에 녹이고 인산을 넣어 pH를 2.4로 조정하고 물을 넣어 1000 mL로 한다.

시티딘의 확인시험 3) 중 “, 280 nm 및 290 nm”를 “ 및 280 nm”로 하고, “E290/E260 = 1.60 ± 0.05”를 삭제한다.

아데노신트리포스페이트이나트륨삼수화물의 확인시험 4)를 다음과 같이 하고 순도시험 4) 흡광도비를 삭제한다.

4) 이 약의 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 7.0)용액(1 → 80000)을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 흡수스펙트럼을 측정할 때 파장 260 nm 부근에서 흡수극대를 나타낸다. 또 파장 250 nm, 260 nm 및 280 nm에서 흡광도 비율은 다음과 같다.

E250/E260 = 0.80 ± 0.2

E280/E260 = 0.15 ± 0.2

아목시실린수화물의 순도시험 4) 시스템적합성 중 “보다 크지 않다.”을 “이상이다.”로 한다.

주사용 아스피린리신의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 20 개 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 단다. 아스피린리신 (C15H22O6N2) 약 0.2 g에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 1 mL 및 물을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 아스피린리신표준품 약 20 mｇ을 정밀하게 달아 물을 넣어 20 mL로 한다. 이 액 10 mL를 취하여 내부표준액 1 mL 및 물을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 아스피린리신의 피크면적비 QT 및 QS를 측정한다.

아스피린리신(C15H22N2O6)의 양 (mg)

= 아스피린리신표준품의 양 (mg) × [eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦ 내부표준액 : 파라옥시벤조산에틸의 메탄올용액 (1 → 1250)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 274 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 30 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 인산염완충액 (pH 3.0)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 약 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 아스피린리신의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

알릴이소프로필아세틸우레아의 순도시험 4) 중금속 중 “20 ppm”을 “10 ppm”으로 한다.

알마게이트 정의 제산력시험 중 “이 약의” 앞에 “이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다.”를 추가하고, “시험한다.” 뒤에 “알마게이트 (건조물로서) 1 g 해당량은 0.1 mol/L 염산 260 mL 이상을 소비한다.”를 추가한다.

알마게이트 현탁액의 제산력시험 중 “시험한다.” 뒤에 “알마게이트 (건조물로서) 1 g 해당량은 0.1 mol/L 염산 260 mL 이상을 소비한다.”를 추가한다.

암브록솔염산염 시럽의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 15 mg을 정밀하게 달아 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 60 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES `2]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 244 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 탄산암모늄 1 g을 물 1000 mL에 녹이고 이 액 430 mL에 아세토니트릴 570 mL를 넣는다.

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 암브록솔의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

암브록솔염산염 정의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 암브록솔염산염(C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다.

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 시럽의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  1) 암브록솔염산염  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다.

2) 클렌부테롤염산염  ｢클렌부테롤염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다.

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 정의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법	1) 암브록솔염산염  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 암브록솔염산염(C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다.

2) 클렌부테롤염산염  ｢클렌부테롤염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 클렌부테롤염산염 약 0.1 mg에 해당하는 양을 취하여 이동상을 60 mL를 넣어 15 분간 추출한 다음 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 10 mg을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다.

암피실린나트륨의 순도시험 5) 디메틸아닐린 시스템 적합성 시스템의 성능 중 “보다 크지 않다.”를 “이상이다.”로 바꾼다.

옥틸로늄브롬화물의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약을 건조하여 약 0.45 g을 정밀하게 달아 비커에 넣고 무수포름산 2 mL를 가하고 아세트산탈수물 50 mL에 녹인 후 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다(적정종말점검출법의 전위차적정법). 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL = 56.357 mg C29H43O4N2Br

카르바조크롬의 순도시험 3) 철을 다음과 같이 한다.

순도시험  3) 철  이 약 0.5 g을 달아 강열하고 그 잔류물에 철시험법 제 1 법에 따라 검액으로 한다. 따로 철표준액 3.0 mL를 취하여 같은 방법으로 조작하여 비교액으로 하고 철시험법 A 법에 따라 시험한다.

카르보닐철의 입도시험 중 “미국약전 표준망체를”을 “체를”로 하고, “325호”를 “330 호”로 한다.

케토티펜푸마르산염 정의 용출시험 중 “이 액 5.0 mL를”을 “이 액 2 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 염산을 넣어 20 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을”로 한다.

콜레칼시페롤·탄산칼슘 캡슐 확인시험 및 정량법 2) 탄산칼슘을 다음과 같이 한다.

확인시험  1) 콜레칼시페롤  이 약을 가지고 비타민시험법에 따라 시험한다.

2) 탄산칼슘 중 칼슘  이 약의 내용물을 가지고 탄산칼슘 0.5 g에 해당하는 양을 묽은염산 10 mL에 녹이고 끓여 식힌 다음 암모니아시액을 넣어 중성으로 한 액은 칼슘염의 정성반응 3)을 나타낸다.

3) 탄산칼슘 중 탄산염  이 약은 탄산염의 정성반응 1)을 나타낸다.

정 량 법  2) 탄산칼슘  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 탄산칼슘 (CaCO3) 200 mｇ에 해당하는 양을 달아 도가니에 넣고 800 ℃에서 강열하여 회화시킨 다음 식힌다. 이 잔류물을 물 10 mL 및 3 mol/L 염산 3 mL에 넣어 녹이고 물을 넣어 150 mL로 한다. 이 액에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣고 0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액으로 적자색에서 파란색이 될 때까지 적정한다(지시약 : 히드록시나프톨블루 300 mg). 물 150 mL에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣어 공시험액으로 하여 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액 1 mL = 5.004 mg CaCO3

콜린알포세레이트 캡슐의 붕해시험을 삭제하고, 확인시험 다음에 용출시험을 다음과 같이 신설한다.

용출시험  이 약 1 캡슐을 취하여 시험액으로 물 900 mL를 써서 용출시험법 제 2 법에 따라 매 분 50 회전으로 시험한다. 용출시험 시작 45 분 후에 용출액을 여과하여 검액으로 한다. 따로 콜린알포세레이트표준품 약 111.1 mg을 정밀하게 달아 물에 녹여 정확하게 25 mL로 한다. 이 액을 여과한 다음 5 mL를 취하여 물에 녹여 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 50 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 콜린알포세레이트의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다. 이 약의 45 분간의 용출률이 85 % 이상일 때 적합하다.

콜린알포세레이트(C8H20NO6P)의 표시량에 대한 용출률 (%)

= [eqn: W _{rm S` it} ` TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} TIMES {1} over {C} ` TIMES `360]

WS : 콜린알포세레이트표준품의 양 (mg)

C : 1 정 중 콜린알포세레이트(C8H20NO6P)의 표시량 (mg)

조작조건

검출기 : 시차굴절계

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 25.0 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용아미노프로필실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 38 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 60 % 아세토니트릴

유  량 : 1.5 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 50 μL씩을 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 콜린알포세레이트의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

주사용 클래리트로마이신의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시역가에 따라 클래리트로마이신 (C38H69NO13) 약 0.5 g (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 세게 흔들어 섞고 1 mL 중 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 2 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 2 mL를 넣은 후 이동상으로 정확하게 20 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 따로 클래리트로마이신표준품 약 50 mg (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 녹여 1 mL 당 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 2 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 2 mL를 넣은 후 이동상으로 정확하게 20 mL로 한 다음 여과하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 클래리트로마이신의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

클래리트로마이신 (C38H69NO13)의 역가 (μg)

= 클래리트로마이신표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}} ` TIMES `10]

◦ 내부표준액  파라옥시벤조산프로필의 이동상용액 (1 → 20000)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 210 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 메탄올·0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 2.0)혼합액 (3 : 2)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질, 클래리트로마이신의 순서로 유출하고 분리도는 3.0 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 내부표준물질의 피크면적에 대한 클래리트로마이신의 피크면적비의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 2.0)  0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액에 인산을 넣어 pH 2.0으로 조정한다.

클래리트로마이신의 정량법 조작조건 칼럼온도 중 “50”을 “40”으로 하고 시스템적합성 시스템의 성능 중 “3.0”을 “1.5”로 한다.

클렌부테롤염산염 시럽의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 클렌부테롤염산염 약 10 μg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 20 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 10 mg을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 200 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 클렌부테롤염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

클렌부테롤염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (μg)

= 클렌부테롤염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {1000}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 215 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 옥탄설폰산나트륨 6 g 및 인산이수소칼륨 5 g을 물 1000 mL에 녹인 다음 인산으로 pH를 3.0으로 조정한 액·아세토니트릴·메탄올혼합액 (3 : 1 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 클렌부테롤의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

클로르페니라민말레산염 주사액의 정량법 중 “정확하게 200 mL로 한다. 이 액 20 mL를 정확하게 달아 100 mL의 분액깔대기에 넣어 수산화나트륨시액 2 mL를 넣은 다음 에테르 50 mL 씩으로 2 회 추출한다.”를 “정확하게 50 mL로 한다. 이 액 10 mL를 정확하게 취하여 0.25 mol/L 황산시액을 넣어 정확하게 25 mL로 하여 검액으로 한다.”로 한다.

탄산칼슘·콜레칼시페롤 정의 한글명 “탄산칼슘·콜레칼시페롤 정”을 “콜레칼시페롤·탄산칼슘 정”으로 하고, 영문명 “Calcium Carbonate and Cholecalciferol Tablets”을 “Cholecalciferol and Calcium Carbonate Tablets”으로 하고, 정량법 중 “2) 콜레칼시페롤”을 “1) 콜레칼시페롤”로 하고, 확인시험 및 정량법 2)를 다음과 같이 하며, 항의 위치를 콜레칼시페롤 항 다음으로 한다.

확인시험  1) 콜레칼시페롤  이 약을 가지고 비타민시험법에 따라 시험한다.

2) 탄산칼슘 중 칼슘  이 약을 가지고 탄산칼슘 0.5 g에 해당하는 양을 묽은염산 10 mL에 녹이고 끓여 식힌 다음 암모니아시액을 넣어 중성으로 한 액은 칼슘염의 정성반응 3)을 나타낸다.

3) 탄산칼슘 중 탄산염  이 약은 탄산염의 정성반응 1)을 나타낸다.

정 량 법	2) 탄산칼슘  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 탄산칼슘 (CaCO3) 200 mｇ에 해당하는 양을 달아 도가니에 넣고 800 ℃에서 강열하여 회화시킨 다음 식힌다. 이 잔류물을 물 10 mL 및 3 mol/L 염산 3 mL에 넣어 녹이고 물을 넣어 150 mL로 한다. 이 액에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣고 0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액으로 적자색에서 파란색이 될 때까지 적정한다(지시약 : 히드록시나프톨블루 300 mg). 물 150 mL에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣어 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액 1 mL = 5.004 mg CaCO3

티로트리신 겔의 정량법 비탁법 (1) 배지 (가) 시험균이식용한천배지 중 “100 g”을 “10.0 g”으로 하고, (2) 시험용균 및 시험용균액을 다음과 같이 하며, (3) 중 “각 군의 시험관에 각 농도의 표준액 및 검액 1.0 mL씩을 각각 취한다.”를 “시험관 3 개를 1 군으로 한다. 표준액의 각 농도마다 각각 1 군으로 하고 또 검액도 1 군을 쓴다. 각 군의 시험관에 각 농도의 표준액 및 검액 100 μL씩을 각각 취하여 넣고 시험용 균액 10 mL 씩을 넣어 마개를 닫은 후 37 ℃에서 3 ∼ 4 시간 배양한다. 따로 에탄올 100 μL와 시험균 부유용 액체배지 10 mL를 넣은 시험관도 같이 배양하여 대조액으로 한다. 배양 후 포름알데히드용액(1 → 3) 0.5 mL 씩을 각 군의 시험관 및 대조액에 넣고 분광광도계를 써서 파장 530 nm에서 평균흡광도를 측정한다.”로 한다.

(2) 시험용균 및 시험용균액 Enterococcus hirae ATCC 10541을 시험용균으로 한다. 시험용균을 시험균이식용한천배지에 접종하여 37 ± 0.5 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양한다. 시험균이식용한천배지 또는 시험균부유용액체배지를 이용하여 37 ± 0.5 ℃에서 적어도 3 회 계대배양하고 마지막 계대의 균은 시험균부유용액체배지 8 ∼ 10 mL에 이식하여 37 ± 0.5 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양하여 균액으로 한다. 쓸 때 이 균액 약 1.0 mL를 시험균부유용액체배지 100 mL에 넣어 시험균액으로 한다. 단, 시험균이식용한천배지 대신 균주특성에 맞는 영양한천배지를 사용할 수 있다.

티오콜키코시드의 흡광도 중 “1 g”을 각각 “10 mg”으로, “100”을 각각 “1000”으로 한다.

티옥트산의 순도시험 2) 황산염 중 “0.05”를 “0.005”로 한다.

파록세틴염산염수화물의 순도시험 2) 유연물질 I 중 “파록세틴유연물질 Ⅰ {(3S,4R)-3-[(1,3-벤조디옥솔-5-일옥시)메틸]-4-(4-에톡시페닐)피페리딘((+)-트랜스-파록세틴)}”를 “파록세틴유연물질Ⅰ {(3S,4R)-3-[(1,3-벤조디옥솔-5-일옥시)메틸]-4-(4-플루오르페닐)피페리딘((+)-트랜스-파록세틴)}”로 한다.

퓨시드산나트륨 정의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 필요하면 당의를 벗기고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한 다음 이 약의 표시역가에 따라 약 250 mg (역가)에 해당하는 양을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 녹여 정확하게 250 mL로 하고 이 액 4 mL를 취해 이동상으로 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 퓨시드산표준품 약 20 mg (역가)을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 50 mL로 하고 이 액 5 mL를 정확하게 취해 이동상을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 퓨시드산의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

퓨시드산 (C31H48O6)의 역가 (μg)

= 퓨시드산표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × 12.5

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 235 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 아세토니트릴·0.05 mol/L 인산용액·메탄올혼합액 (5 : 4 : 1)

유  량 : 1.2 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 퓨시드산의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

프랄리독심염화물의 정량법 중 수식을 다음과 같이 한다.

프랄리독심염화물(C7H9ClN2O)의 양 (mg)

= [eqn: C TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} TIMES 50]

C : 표준액의 농도 (mg/mL)

플루나리진염산염의 순도시험 2) 유연물질 중 “0.40 g을 달아 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)에 녹여 10.0 mL로”를 “0.4 g을 달아 메탄올에 녹여 정확하게 10 mL로”로, “1.0 mL를 취하여 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)을 넣어 50.0 mL로 하고 이 액 5.0 mL를 취하여 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)을 넣어 50.0 mL로”를 “1 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로 하고 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로”로 한다.

플루오로메톨론·테트라히드로졸린염산염 점안현탁액의 확인시험 중 “클로로포름”을 각각 “에틸아세테이트”로 하고, “플루오르메톨론표준품”을 “플루오로메톨론표준품”으로, “(80 : 20 : 20)”을 “(4 : 1 : 1)”로 하며, “클로로포름·에테르·메탄올·17% 암모니아수혼합액 (60 : 60 : 16 : 5)”을 “메탄올·아세트산·물 (8 : 1 : 1)”로 한다.

플루페남산 캡슐의 순도시험 유연물질 중 “클로로포름”을 각각 “에탄올”로, “톨루엔·디옥산·아세트산(100)혼합액 (90 : 25 : 1)”을 “톨루엔·테트라히드로푸란·아세트산(100)혼합액 (90 : 25 : 1)”로 한다.

피나베륨브롬화물의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약을 건조하여 약 0.45 g을 정밀하게 달아 비커에 넣고 무수포름산 2 mL를 가하고 아세트산탈수물 50 mL에 녹인 후 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다(적정종말점검출법의 전위차적정법). 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL = 59.142 mg C26H41Br2NO4

피록시캄 주사액의 정량법을 다음과 같이 한다.

정 량 법  이 약의 표시량에 대하여 피록시캄 (C15H13N3O4S) 40 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 0.01 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 한 다음 5 mL를 취하여 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 피록시캄표준품 약 40 mg을 정밀하게 달아 0.01 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피록시캄의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

피록시캄 (C15H13N3O4S)의 양 (mg)

= 피록시캄표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {it A _{rm T it} rm} over {it A _{rm S it} rm}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 완충액·메탄올·아세토니트릴 혼합액 (41 : 41 : 18)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피록시캄의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

◦ 완충액 : 무수시트르산 7.72 g을 물 400 mL에 녹이고 따로 인산이수소나트륨 5.36 g을 물 100 mL에 녹인다. 인산이수소나트륨용액과 시트르산용액을 합하고 물을 넣어 1000 mL로 하여 섞어 만든다.

대한민국약전 [별표 4] 의약품각조 제2부 일부를 다음과 같이 개정한다.

박하유의 정량법 중 수식 중 “[eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]”를 “[eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}} TIMES {1} over {5}] ”로 한다.

멸균주사용수의 주사제의 불용성이물시험 항목을 불용성이물시험으로 하고 내용을 다음과 같이 한다.

불용성이물시험  시험할 때 적합하여야 한다.

대한민국약전 [별표 5] 일반시험법 일부를 다음과 같이 개정한다.

제26호 산소플라스크연소법의 정량조작법 3) 플루오르 중 “30 ng”을 “30 μg”으로 한다.

제50호 잔류용매시험법을 별지 1과 같이 한다.

총단백질정량법을 제67호로 별지 2와 같이 신설하고, 크기배제 액체크로마토그래프법을 제68호로 별지 3과 같이 신설하며, 펩티드 지도작성법을 제69호로 별지 4와 같이 신설하고, 폴리아크릴아미드겔 전기영동법을 제70호로 별지 5와 같이 신설하며, 제67호부터 제75호까지를 각각 제71호부터 제79호까지로 한다.

제75호 표준품, 시약․시액, 용량분석표준액, 표준액, 색의 비교액, 파장 및 투과율보정용광학필터, 계량기·용기, 멸균법 및 무균조작법의 1) 표준품 유연물질표준품 중 “메틸페니데이트염산염에리스로이성체”를 “메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품”으로 하고, “텔미사르탄유연물질 II {4’-[(1,7’-디메틸-2’프로필l-1H,1’H-2,5’-비벤조[d]이미다졸-1’-일)메틸]비페닐-2-카르본산}”을 “텔미사르탄유연물질 I {1,7′-디메틸-2′-프로필-1H,3′H-2,5′-비벤조[d]이미다졸}, 텔미사르탄유연물질 II {4′-[(1,7′-디메틸-2′-프로필-1H,1′H-2,5′-비벤조[d]이미다졸-1′-일)메틸]비페닐-2-카르복실산}”으로 하며, 2) 시약·시액 중 키니노겐의 수식 중 “0.0096”을 “0.96”으로 한다.

[별지 1]

50. 잔류용매시험법

잔류용매시험법은 기체크로마토그래프법으로 의약품 중의 잔류유기용매의 양을 측정하는 방법이다.

따로 규정이 없는 한 의약품 중의 잔류유기용매의 한도는 ppm으로 표시하며 ｢의약품잔류용매기준지침｣의 제한농도 이하이다.

1. 분류 1 및 분류 2의 용매

장치

기체크로마토그래프

조작법

1) 표준액의 조제

가) 분류 1의 용매 표준원액 : 벤젠, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에텐, 1,1,1-트리클로로에탄을 디메틸설폭시드에 녹여 각각 10,000 ppm, 20,000 ppm, 25,000 ppm, 40,000 ppm, 50,000 ppm이 되도록 한다. 이 액 1 mL를 정확히 취하여 디메틸설폭시드 9 mL를 넣고 물을 넣어 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 정확히 취하여  물을 넣어 100 mL로 하고, 이 액 1 mL를 정확히 취하여 물을 넣어 10 mL로 하여 분류 1의 용매 표준원액으로 한다. 단, 물에 녹지 않는 검체를 시험하는 경우에는 표준원액 제조에 물 대신 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드를 써서 녹인다.

나) 분류 1의 용매 표준액 : 분류 1의 용매 표준원액 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 분류 1의 용매 표준액으로 한다.

다) 분류 2의 용매 표준원액 : 아세토니트릴, 클로로벤젠, 시클로헥산, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 메틸시클로헥산, 톨루엔, 자일렌, 테트라히드로푸란을 디메틸설폭시드에 녹여 각각 2,050 ppm, 1,800 ppm, 19,400 ppm, 9,350 ppm, 3,000 ppm, 1,900 ppm, 15,000 ppm,  5,900 ppm, 4,450 ppm, 10,850 ppm, 3,600 ppm이 되도록 한다, 이 액 1 mL를 정확히 취하여 물을 넣어 100 mL로 하여 분류 2의 용매 표준원액 (I)로 한다. 따로 클로로포름, 1,2-디메톡시에탄, 헥산, 메틸부틸케톤, 니트로메탄, 피리딘, 테트랄린, 1,1,2-트리클로로에텐을 디메틸설폭시드에 녹여 각각 300 ppm, 500 ppm, 1,450 ppm, 250 ppm, 250 ppm, 1,000 ppm, 500 ppm, 400 ppm이 되도록 한다. 이 액 1 mL를 정확히 취하여 물을 넣어 100 mL로 하여 분류 2의 용매 표준원액 (II)로 한다. 단, 물에 녹지 않는 검체를 시험하는 경우에는 표준원액 제조에 물 대신 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드를 써서 녹인다.

라) 분류 2의 용매 표준액 : 분류 2의 용매 표준원액 (I) 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 분류 2의 용매 표준액 (I)로 한다. 따로 분류 2의 용매 표준원액 (II) 5 mL와 물 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 분류 2의 용매 표준액 (II)로 한다.

마) 성분별 표준액 : 제 1 단계 및 제 2 단계 시험결과에 따라 검출된 성분에 대하여 분류 1 또는 분류 2의 용매 표준원액의 첫 번째 희석단계 농도를 참조하여 각 성분을 디메틸설폭시드에 녹인다. 이 액 1 mL를 취하여 물을 넣어 희석하고 단계별로 제 1 단계 및 제 2 단계 시험에서 검액에서 검출된 농도와 유사한 농도로 희석한다. 필요하면 「의약품잔류용매기준지침」의 제한농도의 20 배까지 희석한다. 단, 물에 녹지 않는 검체를 시험할 때는 물 대신 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드에 녹인다. 이 액 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 각 성분별 표준액으로 한다.

2) 검액의 조제

가) 수용성 검체

① 검체 원액 : 검체를 그대로 또는 필요시 일정량 이상을 취하여 용매가 손실되지 않도록 주의하면서 가루로 하여 약 250 mg을 정밀하게 달아 물을 넣어 25 mL로 하여 검체 원액으로 한다.

② 검액 : 검체원액 5 mL와 물 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 검액으로 한다.

③ 표준액 첨가 검액 : 검체 원액 5 mL 과 성분별 표준액 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 표준액 첨가 검액으로 한다.

나) 물에 녹지 않는 검체

① 검체 원액 : 검체를 그대로 또는 필요시 일정량 이상을 취하여 용매가 손실되지 않도록 주의하면서 가루로 하여 약 500 mg을 정밀하게 달아 디메틸포름아미드 또는 디메틸설폭시드를 넣어 10 mL로 하여 검체 원액으로 한다.

② 검액 : 검체원액 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 검액으로 한다.

③ 표준액 첨가 검액 : 검체 원액 1 mL와 성분별 표준액 1 mL 및 물 4 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전하여 표준액 첨가 검액으로 한다.

3) 기체크로마토그래프 조작조건

조작조건 중에서 칼럼의 안지름 및 길이, 충전제의 입자경, 고정상의 농도, 칼럼온도 및 운반기체의 유량은 규정하는 유출순서, 분리도, 대칭계수 및 상대표준편차를 얻을 수 있는 범위 내에서 일부 변경할 수 있다. 또한, 분할 비는 최적의 감도를 얻기 위해 변경할 수 있다. 다만 헤드스페이스용검체주입장치 및 그 조작조건은 규정하는 방법보다 더 좋은 정확도와 정밀도를 얻을 수 있는 범위 내에서 변경할 수 있다.

가) 제 1 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 1.8 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름 0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 3.0 μm의 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 40 ℃로 20 분간 유지한 다음 매분 10 ℃씩 240 ℃까지 승온하고 240 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

분할 비 : 약 1 : 5

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다. 단, 물에 녹지 않는 검체를 시험할 때는 조건 3에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도(℃)	80	105	80
평형시간(분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도(℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 주입구 온도(℃)	80~90	105~115	80~90
최소 가압 시간(초)	60	60	60
주입량 (mL)	1	1	1

시스템적합성

검출의 확인 : 분류 1의 용매 표준액에서 1,1,1-트리클로로에탄 피크의  신호 대 잡음비는 5 이상이고, 시스템적합성용액에서 각 피크의 신호  대 잡음비는 3 이상이다.

시스템의 성능 : 분류 2의 용매 표준액 (I)에서 아세토니트릴과 디클로로메탄의 분리도는 1.0 이상이다.

◦ 시스템적합성 용액 : 분류 1의 용매 표준원액 1 mL와 검액 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전한다. 단, 물에 녹지 않은 검체를 시험할 때는 분류 1의 용매 표준원액에서 마지막 희석단계 바로 직전의 액 0.5 mL와 검체 원액 5mL를 잘 섞고 이 액 1 mL와  물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전한다.

나) 제 2 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)의 을 2.5 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름  0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)을 0.25 μm 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 50 ℃로 20 분간 유지하고 다음 매분 6 ℃씩 165 ℃까지 승온하고 165 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

분할 비 : 약 1 : 5

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다. 단, 물에 녹지 않는 검체를 시험할 때는 조건 3에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도(℃)	80	105	80
평형시간(분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도(℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 주입구 온도(℃)	80～90	105～115	80～90
최소 가압 시간(초)	60	60	60
주입량 (mL)	1	1	1

시스템적합성

검출의 확인 : 분류 1의 용매 표준액에서 벤젠 피크의 신호 대 잡음비는 5 이상이고, 시스템적합성용액에서 각 피크의 신호 대 잡음비는 3 이상이다.

시스템의 성능 : 분류 2의 용매 표준액 (I)에서 아세토니트릴과 시스-디클로로에텐의 분리도는 1.0 이상이다.

◦ 시스템적합성 용액 : 분류 1의 용매 표준원액 1 mL와 검액 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전한다. 단, 물에 녹지 않은 검체를 시험할 때는 분류 1의 용매 표준원액에서 마지막 희석단계 바로 직전의 액 0.5 mL와 검체 원액 5 mL를 잘 섞고 이 액 1 mL와  물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣어 밀전한다.

4) 시험방법

제 1 단계 시험

검액 및 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (I), 분류 2의 용매표준액 (II)을 기체크로마토그래피 조작조건 제 1 법의 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 크로마토그램으로부터 피크면적을 구한다. 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적보다 작고, 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적은 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배 보다 작다.

제 2 단계 시험

제 1 단계 시험에서 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적과 같거나 큰 경우, 또는 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배와 같거나 큰 경우는 기체크로마토그래프 조작조건 제 2 법으로 다시 시험한다.  제 1 법에 따라 시험하였을 때 확인된 성분은 제 2 법에 따라 시험하였을 때 검액 중 그 성분의 피크면적은 표준액 중 해당 성분의 피크면적보다 작다.

제 3 단계 시험

제 2 단계 시험에서 검액 중 해당 성분의 피크면적이 표준액 중 해당 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 검출된 성분에 대하여 검액, 성분별 표준액 및 표준액 첨가 검액을 가지고 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법으로 시험하여 검액 및 표준액 첨가 검액에서의 피크면적 AT 및 AST로부터 검액 중 잔류용매의 양을 계산한다.

2. 분류 2 및 분류 3의 용매

장치

기체크로마토그래프

조작법

1) 표준액의 조제

가) 분류 2A 및 분류 3A의 용매 표준액의 조제

① 분류 2A의 용매 표준원액

아세토니트릴, 클로로벤젠, 크멘, 시클로헥산, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 메틸시클로헥산, 테트라히드로푸란, 톨루엔, 자일렌을 디메틸설폭시드에 녹여 아래 표와 같이 희석하여 분류 2A의 용매 표준원액으로 한다.

용매	조제 농도 (mg/mL)
아세토니트릴	2
클로로벤젠	1.7
크멘	0.3
시클로헥산	16
1,2-디클로로에텐	9
디클로로메탄	3
1,4-디옥산	1.8
메탄올	14.5
메틸시클로헥산	5
테트라히드로푸란	3.5
톨루엔	4
자일렌	10.5

② 분류 3A의 용매 표준원액

아세톤, 아세트산에틸, 디에틸에테르, 2-프로판올, 아세트산이소부틸, 2-부탄올 각 250 mg 씩 정밀하게 달아 각각 10 mL 용량플라스크에 넣고 디메틸설폭시드를 넣어 10 mL로 한다.

③ 분류 2A 및 분류 3A 용매 표준액

분류 2A의 용매 표준원액 1 mL를 정확하게 취해 100 mL 용량플라스크에 넣고 분류 3A의 용매 표준원액 1 mL를 넣은 다음 물을 넣어 100 mL로 하여 표준원액(I)으로 한다. 이액 1 mL 및 물 5 mL를 각각 취하여 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액(I)로 한다.

나) 분류 2B 및 분류 3B의 용매 표준액의 조제

① 분류 2B의 용매 표준원액

클로로포름, 1,2-디메톡시에탄, 헥산, 메틸부틸케톤, 니트로메탄, 피리딘, 테트랄린, 1,1,2-트리크로로에텐을 디메틸설폭시드에 녹여 아래 표와 같이 희석하여 분류 2B의 용매 표준원액으로 한다.

용매	조제 농도 (μg/mL)
클로로포름	60
1,2-디메톡시에탄	97
헥산	186
메틸부틸케톤	50
니트로메탄	49
피리딘	200
테트랄린	97
1,1,2-트리클로로에텐	78

② 분류 3B의 용매 표준원액

에탄올, 아세톤, t-부틸메틸에테르, 아세트산에틸, 1-부탄올 각 50 mg 씩 정밀하게 달아 각각 10 mL 용량플라스크에 넣고 디메틸설폭시드를 넣어 10 mL로 한다.

③ 분류 2B 및 분류 3B 용매 표준액

분류 2B의 용매 표준원액 1 mL를 정확하게 취해 100 mL 용량플라스크에 넣고 분류 3B의 용매 표준원액 1 mL를 넣은 다음 물을 넣어 100 mL로 하여 표준원액(II)로 한다. 이 액 5 mL 및 물 1 mL를 각각 취하여 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액 (Ⅱ)로 한다.

다) 성분별 표준액

시험방법 중 제 1 단계 및 제 2 단계 시험결과에 따라 검출된 성분에 대하여 표준원액 (I) 및 표준원액 (Ⅱ)의 농도를 참조하여 각 성분 표준품을 디메틸설폭시드에 녹인다(성분별로 각각 제조한다). 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 물을 넣어 희석하고 단계별로 제 1 단계 및 제 2 단계 시험에서 검액에서 검출된 농도와 유사한 농도로 희석한다. 필요하면 ｢의약품잔류용매기준지침｣의 제한농도의 20 배까지 희석한다.

이 액 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 각 성분별 표준액으로 한다.

2) 검액의 조제

가) 검액 원액 :　검체 약 250 mg을 정밀하게 달아 물을 넣어 25 mL로 하여 검액 원액으로 한다.

나) 검액 : 검체 원액 5 mL와 물 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 검액으로 한다.

다) 표준액 첨가 검액 : 검체 원액 5 mL과 성분별 표준원액 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액 첨가 검액으로 한다.

3) 기체크로마토그래프 조작조건

조작조건 중에서 칼럼의 안지름 및 길이, 충전제의 입자경, 고정상의 농도, 칼럼온도 및 운반기체의 유량은 시스템적합성을 얻을 수 있는 범위 내에서 일부 변경할 수 있다. 또한, 분할비는 최적의 감도를 얻기 위해 변경할 수 있다. 다만 헤드스페이스용 검체도입장치 및 그 조작조건은 규정하는 방법보다 더 좋은 정확도와 정밀도를 얻을 수 있는 범위 내에서 변경할 수 있다.

가) 제 1 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 1.8 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름 0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 3.0 μm의 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 30 ℃로 20 분간 유지한 다음 매분 10 ℃씩 240 ℃까지 승온하고 240 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

유량 : 약 20 cm/초

분할비 : 약 1 : 5

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도 (℃)	80	105	80
평형시간 (분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도 (℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 도입구 온도 (℃)	80 ∼ 90	105 ∼ 115	80 ∼ 90
최소 가압 시간 (초)	60	60	60
주입량 (mL)	1	1	1

단, 잔류용매 각 성분의 유출순서는 다음과 같다.

1. 분류 2A 및 분류 3A의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	메탄올 (Methanol)	분류 2
2	디에틸에테르 (Diethyl ether)	분류 3
3	아세톤 (Acetone)	분류 3
4	2-프로판올 (2-Propanol)	분류 3
5	아세토니트릴 (Acetonitrile)	분류 2
6	디클로로메탄 (Methylene chloride)	분류 2
7	1,2-디클로로에텐 (trans-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
8	1,2-디클로로에텐 (cis-Dichloroethene)
9	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
10	테트라히드로푸란 (Tetrahydrofuran)	분류 2
11	2-부탄올 (2-Butanol)	분류 3
12	시클로헥산 (Cyclohexane)	분류 3
13	메틸시클로헥산 (Methyl cyclohexane)	분류 2
14	1,4-디옥산 (1,4-Dioxane)	분류 2
15	톨루엔 (Toluene)	분류 2
16	아세트산이소부틸 (Isobutyl acetate)	분류 3
17	클로로벤젠 (Chlorobenzene)	분류 2
18	에틸벤젠 (Ethyl benzene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
19	m-, p-자일렌 (m,p-Xylene)
20	o-자일렌 (o-Xylene)
21	크멘 (Cumene)	분류 2

2. 분류 2B 및 분류 3B의 용매

유출순서	잔류용매(분류 2B + 3)	비고
1	에탄올 (Ethanol)	분류 3
2	아세톤 (Acetone)	분류 3
3	t-부틸메틸에테르 (Methyl tert-butylether)	분류 3
4	헥산 (Hexane)	분류 2
5	니트로메탄 (Nitromethane)	분류 2
6	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
7	클로로포름 (Chloroform)	분류 2
8	1,2-디메톡시에탄 (1,2-Dimethoxyethane)	분류 2
9	1,1,2-트리클로로에텐 (1,1,2-Trichloroethene)	분류 2
10	1-부탄올 (1-Butanol)	분류 3
11	피리딘 (Pyridine)	분류 2
12	메틸부틸케톤 (Methylbutylketone)	분류 2
13	테트랄린 (Tetralin)	분류 2

시스템적합성

검출의 확인: 시스템적합성 용액에서 각 피크의 신호 대 잡음비는 10 이상이다.

시스템의 성능: 시스템적합성 용액을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피크면적의 상대표준편차는 10.0 % 이하이고, 인접한 피크와의 분리도는 1.5 이상이다. 다만, 2-프로판올 피크와 아세토니트릴 피크의 분리도는 1.0 이상이다.

◦ 시스템적합성 용액: 분석대상 잔류용매를 포함하여 최소 3개 이상의 용매를 선정하여 표준액의 제법과 같이 조제한다.

나) 제 2 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)을 0.25 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름  0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)을 0.25 μm 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 40 ℃로 20 분간 유지하고 다음 매분 6 ℃씩 165 ℃까지 승온하고 165 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

분할 비 : 약 1 : 5

유량 : 약 20 cm/초

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도 (℃)	80	105	80
평형시간 (분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도 (℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 도입구 온도 (℃)	80 ∼ 90	105 ∼ 115	80 ∼ 90
최소 가압 시간 (초)	60	60	60
주입량 (mL)	1	1	1

단, 잔류용매 각 성분의 유출순서는 다음과 같다.

1. 분류 2A 및 분류 3A의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	디에틸에테르 (Diethyl ether)	분류 2
2	시클로헥산 (Cyclohexane)	분류 3
3	메틸시클로헥산 (Methyl cyclohexane)	분류 2
4	아세톤 (Acetone)	분류 3
5	테트라히드로푸란 (Tetrahydrofuran)	분류 2
5	1,2-디클로로에텐 (trans-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
6	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
7	메탄올 (Methanol)	분류 2
8	디클로로메탄 (Methylene chloride)	분류 2
9	2-프로판올 (2-Propanol)	분류 3
10	1,2-디클로로에텐 (cis-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
11	아세토니트릴 (Acetonitrile)	분류 2
12	이소부틸아세테이트 (Isobutyl acetate)	분류 3
13	톨루엔 (Toluene)	분류 2
14	2-부탄올 (2-Butanol)	분류 3
15	1,4-디옥산 (1,4-Dioxane)	분류 2
16	에틸벤젠 (Ethyl benzene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
17	p-자일렌 (p-Xylene)
18	m-자일렌 (m-Xylene)
19	크멘 (Cumene)	분류 2
20	o-자일렌 (o-Xylene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
21	클로로벤젠 (Chlorobenzene)	분류 2

2. 분류 2B 및 분류 3B의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	헥산 (Hexane)	분류 2
2	t-부틸메틸에테르 (Methyl tert-butylether)	분류 3
3	아세톤 (Acetone)	분류 3
4	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
5	1,2-디메톡시에탄 (1,2-Dimethoxyethane)	분류 2
6	에탄올 (Ethanol)	분류 3
7	1,1,2-트리클로로에텐 (1,1,2-Trichloroethene)	분류 2
8	클로로포름 (Chloroform)	분류 2
9	메틸부틸케톤 (Methylbutylketone)	분류 2
10	니트로메탄 (Nitromethane)	분류 2
11	1-부탄올 (1-Butanol)	분류 3
12	피리딘 (Pyridine)	분류 2
13	테트랄린 (Tetralin)	분류 2

시스템적합성

검출의 확인: 시스템적합성 용액에서 각 피크의 신호 대 잡음비는 10 이상이다.

시스템의 성능: 시스템적합성 용액을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피크면적의 상대표준편차는 10.0 % 이하이고, 인접한 피크와의 분리도는 1.5 이상이다. 다만, p-자일렌 피크와 m-자일렌 피크의 분리도는 1.0 이상이다.

◦ 시스템적합성 용액: 분석대상 잔류용매를 포함하여 최소 3 개 이상의 용매를 선정하여 표준액의 제법과 같이 조제한다.

4) 시험방법

제 1 단계 시험

검액, 표준액 (I) 및 표준액 (II)를 기체크로마토그래피 조작조건 제 1 법의 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 크로마토그램으로부터 피크면적을 구한다. 검액 중 각 성분의 피크면적이 표준액 (I) 및 표준액 (II)의 각 성분의 피크면적보다 작다.

제 2 단계 시험

제 1 단계 시험에서 검액 중 각 성분의 피크면적이  표준액 (I) 및 표준액 (II)의 각 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 기체크로마토그래프 조작조건 제 2 법으로 다시 시험한다. 제 1 법에 따라 시험하였을 때 확인된 성분은 제 2 법에 따라 시험하였을 때 검액 중 그 성분의 피크면적은 표준액 중 해당 성분의 피크면적보다 작다.

제 3 단계 시험

제 2 단계 시험에서 검액 중 해당 성분의 피크면적이 표준액 중 해당 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 검출된 성분에 대하여 검액, 성분별 표준액 및 표준액 첨가 검액을 가지고 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법으로 시험하여 검액 및 표준액 첨가 검액에서의 피크면적 AT 및 AST로부터 검액 중 잔류용매의 양을 계산한다.

검액 중 잔류용매의 양 (ppm) =

[eqn: {LEFT ( C ``TIMES `n RIGHT )} over {W} ` TIMES ` LEFT [ {A _{rm T}} over {LEFT ( A _{rm ST} ``-`A _{rm T} RIGHT )} RIGHT ]]

C : 표준액의 농도 (μg/mL)

W : 검체 채취량 (g)

n : 표준원액에서부터의 희석배수

3. 분류 3의 용매

검액 및 표준액을 가지고 기체크로마토그래프법에 따라 시험한다. 다만 의약품각조에 검체 및 표준품의 채취량, 조제법, 주입량, 헤드스페이스장치의 조작조건 및 기체크로마토그래프의 조작조건 등 시험에 필요한 사항을 규정한다.

검액 및 표준액
↓
제 1 단계 시험
↓
검액 중 잔류용매의 피크가 표준액 중 해당 피크의 면적보다 작은가 ?
	예 →	적합 : 시험종료
↓아니오
제 2 단계 시험
↓
검액 중 잔류용매의 피크가 표준액 중 해당 피크의 면적보다 작은가 ?
	예 →	적합 : 시험종료
↓아니오
제 3 단계 시험
↓
검액 중 검출된 잔류용매의 양 계산할 때 한계치 이하인가?
	예 →	적합 : 시험종료
↓아니오
부적합

그림 1. 단계별 시험 흐름도 및 판정

표 1. 용매 분류

분류 1의 용매	벤젠, 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에텐, 1,1,1-트리클로로에탄
분류 2의 용매	아세토니트릴, 클로로벤젠, 클로로포름, 크멘, 시클로헥산, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 1,2-디메톡시에탄, N,N-디메틸아세트아미드, N,N-디메틸포름아미드, 1,4-디옥산, 2-에톡시에탄올, 에틸렌글리콜, 포름아미드, 헥산, 메탄올, 2-메톡시에탄올, 메틸부틸케톤, 메틸시클로헥산, N-메틸피롤리돈, 니트로메탄, 피리딘, 설폴란, 테트라히드로푸란, 테트랄린, 톨루엔, 1,1,2-트리클로로에텐, 자일렌주)
분류 3의 용매	아세트산, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 아세트산 n-부틸, t-부틸메틸에테르, 디메틸설폭시드, 에탄올, 아세트산에틸, 디에틸에테르(에테르), 포름산에틸, 포름산, 헵탄, 아세트산이소부틸, 아세트산이소프로필, 아세트산메틸, 3-메틸-1-부탄올, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세트산프로필

주) 일반적으로 17 % 에틸벤젠을 함유하는 60 % m-자일렌, 14 % p-자일렌, 9 % o-자일렌

[별지 2]

67. 총단백질정량법

단백질을 정량하는 방법은 단백질을 구성하고 있는 아미노산들의 자외부흡광과 같은 단백질 자체의 물리적 특성을 이용하는 방법과 특정물질과 단백질간의 화학반응을 통해 흡광파장을 가시광선부 범위내로 변화시킨 후 흡광도를 측정하는 방법이 있다. 가시광선흡광측정의 경우, 화학반응 정도는 단백질의 양에 비례하게 되며 발색반응이기 때문에 흡광도가 증폭되어 민감도가 증가하는 장점이 있다.

자외선 흡광도법  용액 중 단백질은 단백질 구조상 주로 티로신과 트립토판과 같은 방향족 아미노산에 의해 280 nm의 파장에서 자외선을 흡수한다. 이러한 특성을 이용하여 용액 속의 단백질을 정량할 수 있다. 단백질을 녹이기 위해 사용되는 완충액이 물에 비해 상대적으로 높은 흡광도를 갖는다면 완충액 내에는 간섭물질이 존재하는 것이다. 이러한 간섭 작용은 완충액을 보정액으로 사용하여 제거하거나 최소화할 수도 있지만 간섭물질이 높은 흡광도를 나타낸다면 적절한 결과를 얻지 못할 수 있다. 측정하고자 하는 단백질 농도가 낮으면 셀 (cell)에 단백질이 흡착되어 측정값이 현저히 감소될 수 있다. 이것은 단백질 농도를 높이거나 완충액을 만들 때 비이온성 계면활성제를 사용하여 해결할 수 있다.

조작법  측정하는 동안 검액, 표준액 및 보정액을 같은 온도로 유지한다. 조제된 완충액을 보정액으로 이용하고 검액과 표준액을 석영 셀에 넣은 후 280 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정된 단백질 농도의 값은 해당 흡광도가 직선으로 된 검량선 구간에 있을 때 정확한 값을 구할 수 있다.

1) 검액  측정할 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 단백질 농도가 0.2 〜 2 mg/mL가 되도록 한다.

2) 표준액  측정할 표준물질을 검액 조제시 사용한 완충액으로 희석하여 검액의 단백질 농도와 동일하게 만든다.

광산란  검체에 의한 광산란으로 인해 단백질의 자외선분광의 정확성이 감소될 수 있다. 용액 중 단백질이 분석에 사용되는 파장과 비슷한 크기(250 nm ∼ 300 nm)라면 산란으로 인해 검체의 흡광도가 명백히 증가하게 된다. 280 nm에서 광산란에 의한 흡광도를 계산하기 위해 320 nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm 및 350 nm 파장에서 검액의 흡광도를 측정하고 이 측정값들의 로그값과 각 측정 파장의 로그값으로 그래프를 그린다. 다음으로 선형희귀에 의해 그래프 상의 좌표값들을 가장 잘 반영하는 표준곡선을 그린다. 이 곡선을 외삽하여 280 nm에서의 흡광도 로그값을 계산한 후 그 진수(antilogarithm value)를 구하면 이 값이 280 nm에서 광산란에 의한 흡광도가 된다. 280 nm에서 측정된 총 흡광도에서 광산란에 의한 흡광도를 빼서 보정한 값이 용액 내의 단백질의 흡광도이다. 특히 용액이 현저히 혼탁할 경우 단백질 흡착이 안 되는 0.2 μm 여과막을 사용하여 여과하거나 원심분리를 이용하여 광산란에 의한 영향을 감소시킬 수 있다.

계산법  검액 내 단백질 농도는 다음 식으로 보정값을 이용하여 구한다. 필요한 경우 흡광계수를 적용할 수 있다.

CU = CS(AU/AS)

CU : 검액 중 단백질 농도

CS : 표준액 중 단백질 농도

AU : 검액의 보정된 흡광도 값

AS : 표준액의 보정된 흡광도 값

로리법  로리법은 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액 또는 폴린시오칼토페놀시액)내 인몰리브덴산텅스텐 혼합산 색소원(chromogen)이 단백질에 의해 환원되고 이로 인한 발색이 750 nm 파장에서 최대 흡광도를 보이는 원리를 이용한 방법이다. 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액)은 단백질 내 티로신잔기와 주로 반응하여 상온에서 20 〜 30분간 발색되었다가 서서히 발색이 사라진다. 이 방법은 간섭물질에 민감하기 때문에 검체로부터 단백질을 침전시킨 후 사용한다. 대부분의 간섭 물질은 발색을 감소시키지만 일부 계면활성제는 발색을 약간 증가시킨다. 고농도의 염은 인몰리브덴산텅스텐산과 단백질 결합체를 침전시킬 수 있다. 단백질의 종류에 따라 다른 강도의 발색 반응을 나타낼 수 있어, 가능한 표준물질과 검체는 동일한 종류의 단백질을 사용한다. 표준물질이 따로 없을 경우에는 단백질정량용 알부민 등으로 대체한다. 검체 내에 단백질로부터 간섭물질을 분리하고자 할 경우 검액을 준비하기 전에 간섭물질을 아래의 간섭물질 제거 방법에 따라 분리한다. 정확한 측정을 위해 검체가 충분히 고농도일 경우에는 희석배수를 높여 간섭물질의 영향을 최소화할 수 있다.

조작법  알칼리성구리시액 1 mL를 각각 1 mL의 표준액, 검액 및 공시험액에 가한 후 진탕 혼합한다. 10 분간 정치시킨 후 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액) 희석액 0.5 mL를 가하고 진탕 혼합한 다음, 30 분간 상온에서 정치시킨 후 공시험액을 보정액으로 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정한다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준곡선 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다. 완충액 내 적정 pH 범위는 10.0 ∼ 10.5이다.

2) 표준액   조제된 완충액에서 단백질이 측정되도록 표준액을 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질함량 5 〜 100 μg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 황산구리시액  황산구리 100 mg과 타르타르산나트륨 0.2 g을 물로 녹여 50 mL가 되게 희석한다. 무수탄산나트륨 10 g을 물로 녹여 50 mL가 되게 한다. 천천히 탄산나트륨용액을 황산구리용액에 가하여 진탕 혼합한 다음 24시간 이내에 사용한다.

5) 알칼리성구리시액  황산구리시액․도데실황산나트륨액 (50 g/L)․수산화나트륨액 (32 g/L)혼합액(1 : 2 : 1)을 상온에서 보관하고 2주 이내에 사용한다.

6) 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액)  물 700 mL에 텅스텐산나트륨 100 g 및 몰리브덴산나트륨 25 g을 넣어 녹이고 염산 100 mL 및 인산 50 mL를 넣고 환류냉각기를 달아 10 시간 동안 가열한다. 이것에 황산리튬 150 g, 물 50 mL 및 브롬 몇 방울을 넣고 과량의 브롬을 제거하기 위해 약 15 분간 끓인다. 식힌 다음 물을 넣어 1000 mL로 하고 여과한다. 이 시액은 노란색이다. 초록색조가 나타나면 적합하지 않으며 이러한 경우는 브롬 몇 방울을 넣고 다시 끓여서 재생할 수 있다.

7) 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액) 희석액  폴린시액 5 mL을 물 55 mL로 혼합한 다음, 황갈색 병에 옮긴 후 상온에서 보관한다.

8) 데옥시콜산-트리클로로아세트산  데옥시콜산나트륨․트리클로로아세트산혼합액(1 : 1)

데옥시콜산나트륨  데옥시콜산나트륨 150 mg을 물 100 mL에    녹여 1.5 g/L로 한다.

트리클로로아세트산  트리클로로아세트산 72 g에 물 100 mL에   녹여 720 g/L로 한다.

간섭물질  간섭물질을 제거하기 위해 측정 전 검체에 데옥시콜산-트리클로로아세트산을 가하여 단백질을 침전시킨 후 측정할 수 있다. 이 방법은 희석액으로부터 단백질을 농축시키는데 사용된다.

측정할 검체에 데옥시콜산나트륨액 0.1 mL (1.5 g/L)를 가한 다음 교반기로 교반시킨 후 10 분간 상온에 정치시킨다. 다시 트리클로로아세트산 0.1 mL (720 g/L)를 가한 후 교반기로 교반시킨다. 그 다음 3000 g에서 30 분간 원심 분리한다. 상층액을 버리고 잔류된 액은 파이펫으로 제거한다. 단백질 침전물은 1 mL 알칼리성구리시액을 가하여 다시 녹인다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 표준액의 단백질농도와 흡광도간 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 단백질 농도를 결정한다.

브래드포드법  이 방법은 산 블루 90 색소가 단백질과 결합하여 최대흡광파장이 470 nm에서 595 nm로 이동하는 원리를 이용한 것이다.

산 블루 90 색소는 단백질 내 아르기닌 및 리신 잔기에 가장 쉽게 결합한다. 따라서 단백질에 따라 시험반응이 다양할 수 있어 반드시 같은 종류의 단백질을 표준물질로 사용하여 검체의 단백질 함량을 측정해야 한다. 이 방법은 상대적으로 간섭물질의 영향을 거의 받지 않지만 검체 내에 계면활성제와 양성전해질이 있는 것은 피해야 한다. 강한 알칼리성 검체는 산성시액의 반응을 방해할 수 있다.

조작법  산 블루 90 시액 5 mL를 각각 0.1 mL의 표준액, 검액 및 공시험액에 가한 다음 상하로 교반하여 혼합한다. 이때 거품이 생기지 않도록 한다. 거품형성은 재현성을 떨어트릴 수 있다. 공시험액을 보정액으로 사용하여 595 nm에서 표준액과 검액의 흡광도를 측정한다. 색소가 석영에 결합할 수 있기 때문에 석영 셀을 사용하지 않는다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준곡선 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다.

2) 표준액  조제된 완충액에서 단백질이 측정되도록 표준액을 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질함량 0.1 〜 1 mg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 산 블루 90 시액  산 블루 90 0.1 g을 알코올로 녹여 50 mL가 되게 한다. 그 다음 이 용액에 100 mL 인산을 가한 후 물로 1000 mL가 되게 희석하여 혼합한다. 용액을 여과 후 황갈색 병에 옮긴 후 상온에서 보관한다. 보관 시 색소가 천천히 침전하므로, 여과하여 사용한다.

계산법   흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 단백질 농도를 결정한다.

비신코닌산법(BCA법) 비신코닌산법은 단백질에 의해 2가 구리이온(Cu2+)이 1가 구리이온(Cu1+)으로 환원되는 반응을 이용한다. 비신코닌산시액은 1가 구리이온(Cu1+)을 위해 사용한다. 이 방법은 간섭물질의 영향을 거의 받지 않지만 검체 내에 간섭물질이 있을 경우 간섭물질의 영향은 희석에 의해 최소화 시킬 수 있다. 하지만 검체 단백질 농도는 정확한 측정을 위해 충분한 양이 있어야 한다. 다른 방법으로는 로리법처럼 검체로부터 단백질을 침전시켜 간섭물질을 제거시킬 수 있다. 단백질 종류에 따라 다른 발색정도를 나타낼 수 있어 표준물질 단백질과 검체 단백질은 동일 종류여야 한다.

조작법  구리-비신코닌산시액 2 mL를 각각 0.1 mL의 표준액, 검액 및 완충액에 가하여 혼합한 다음 37 ℃에서 30 분간 둔다. 시간을 기록하고 상온까지 혼합물을 식히는 것이 허용된다.

반응 종료 후 60 분 이내에 반응액을 석영 셀에 옮긴 후 공시험액을 보정액으로 사용하여 562 nm에서 흡광도를 측정한다. 반응액 온도가 상온으로 되면 발색 강도는 점차적으로 증가된다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준액 농도 범위 안에 들어갈 수 있도록 만든다.

2) 표준액  측정할 표준물질을 완충액으로 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질 함량 10 〜 1200 μg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 비신코닌산시액 (BCA시액) 비신코닌산이나트륨 (disodium bicinchoninate) 10 g, 탄산나트륨일수화물 20 g, 타르 타르산나트륨 1.6 g, 수산화나트륨 4 g, 탄산수소나트륨 9.5 g을 물에 녹인 후 필요시 수산화나트륨용액이나 탄산수소나트륨용액을 가하여 pH를 11.25가 되도록 조절한 다음, 물을 가하여 1 L가 되게 한다.

5) 구리-비신코닌산시액 황산구리용액 (4 g/L) 1 mL와 비신코닌산시액 50 mL를 혼합한다.

계산법   흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 검액 중 단백질 농도를 결정한다.

뷰렛법  이 방법은 알칼리성 조건에서 2가 구리이온(Cu2+)을 단백질 용액과 반응시켰을 때, 발색 반응을 545 nm의 흡광도에서 측정하는 것이다. 이 분석법은 타분석법과 달리 단백질 종류가 달라도 발색정도의 차이가 매우 작다. 예를 들어 동량의 면역글로불린-G와 알부민 검체를 측정 시에 측정결과의 차이가 거의 없다. 그렇지만 뷰렛시액에 수산화나트륨용액을 가할 때 충분히 혼합되지 않을 경우와 혼합 후 반응시간이 길어진 경우에는 면역글로블린-G가 알부민보다 높은 흡광도를 나타낼 수 있기에 이러한 점들은 주의해야한다. 검체 내 간섭물질의 영향을 최소화하기 위해 트리클로로아세트산을 가하여 500 μg/mL 미만의 검체 중 단백질 농도로 측정할 수도 있다.

조작법 검액, 표준액 및 공시험액에 동량의 수산화나트륨용액 (60 g/L)을 가한 후 혼합한다. 이 혼합액에서 검액의 0.4 배 용량만큼  취하여 뷰렛시액을 가하고 바로 혼합한다. 15 〜 25 ℃ 온도 조건에서 적어도 15 분 이상 반응시킨다. 표준액과 검액에 뷰렛시액을 가하고 90 분 이내에 공시험액을 보정액으로 사용하여 545 nm에서 최대흡광도를 측정한다. 단백질 농도 측정시 시액이 혼탁해지거나 침전물이 생긴 경우 사용하지 않는다.

1) 검액  적당량의 검체를 염화나트륨용액 (9 g/L)으로 희석하여 표준액 농도 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다.

2) 표준액  표준물질을 염화나트륨용액 (9 g/L)에 녹인 후, 희석하여 단백질 함량 0.5 〜 10 mg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 3개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  염화나트륨용액 (9 g/L)을 사용한다.

4) 뷰렛시액  황산구리 3.46 g을 뜨거운 물로 녹여 10 mL가 되도록 하고 차갑게 식혀 용액 A를 만들고, 시트르산나트륨 (이수화물) 34.9 g과 무수탄산나트륨 20.0 g을 뜨거운 물로 녹이고 식혀서 용액 B를 만든다. 용액 A와 용액 B를 혼합 후 물로 희석하여 200 mL가 되도록 한다. 이 혼합액은 6개월 이내에 사용한다. 만약 시액이 혼탁해지거나 침전물이 생길 경우 사용하지 않는다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 제시된 표준액 구간에서 대략 선형이다. 단백질 농도와 표준액의 흡광도간 선형회귀를 사용하여 표준곡선을 그릴 수 있다. 이때 표준곡선(검량선)의 상관계수를 구할 수 있고 적어도 0.99 이상이어야 적절하다. 표준곡선과 검액의 흡광도로부터 검액 중 단백질 농도를 결정한다.

간섭물질  간섭물질의 영향을 최소화하기 위해 검체 내 단백질은 다음과 같이 침전시키고 사용할 수 있다. 검액 용량 대비 0.1 배의 트리클로로아세트산용액 (500 g/L)을 가한 후, 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물은 소량의 수산화나트륨용액 (0.5 mol/L)으로 녹인다.

[별지 3]

68. 크기배제 액체크로마트그래프법

크기배제 액체크로마토그래프법은 분자의 크기 차이를 이용하여 용액 내 물질을 분리하는 방법이다. 이동상 용매에 따라 유기용매를 사용하는 방법을 겔침투크로마토그래프법, 수용성용매를 이용하는 방법을 겔여과크로마토그래프법이라고 한다. 물질 분리 원리는 다공성 겔을 칼럼에 충전하고 여기에 시료를 주입한 후 이동상을 흘려보내면 겔 입자 내에서 이동상 용매와 고정상의 동일 용매 사이의 용질 분자의 반복적 교환에 의해 분자크기에 따른 분리가 일어나고 충전된 겔의 공극 (pore) 크기가 분리되는 분자량 범위를 결정한다.

특정 크기의 공극을 가진 겔에서 충분히 작은 분자는 겔 사이의 공간과 공극내 공간 (겔 총 침투용적, Vt)을 모두 통과한 후 용출된다. 즉 이동상이 겔 총 침투용적 (Vt)만큼 흐른 후 용출되게 된다. 하지만 매우 큰 크기의 분자는 공극내 공간에 머무르지 못하고 겔 사이의 공간 (배제용적, Vo)만을 통과하여 용출된다. 즉 이동상이 배제용적 (Vo)만큼 흐른 후 용출되게 된다. 그리고 중간 크기의 분자들은 이동상이 겔 총 침투용적 (Vt)과 배제용적 (Vo)사이의 어느 용적 (부피)만큼 흐른 후 용출된다. 일반적으로 물질의 분리는 겔 총 침투용적과 배제용적 사이 첫 2/3 정도에서 일어난다.

기본이 되는 장치는 다양한 길이와 내경을 갖는 칼럼이다. 칼럼은 필요에 따라 온도를 조절할 수 있고 적절한 분자크기 범위 내에서 물질을 분리할 수 있으며 일정한 속도로 유출 조절이 되어야 한다. 칼럼 한쪽 끝은 유입부로, 검체를 주입할 수 있는 주입구 같은 적절한 장치와 용출을 조절할 수 있는 펌프가 연결되어야 한다. 반대쪽 끝은 유출부로, 검체를 분리하여 조성물별로 상대적 농도를 측정할 수 있는 검출기에 연결되어야 한다. 여기에 자동기록계가 장착될 수 있다.

검출기는 일반적으로 흡광도, 굴절도, 발광 등의 특성을 이용한다. 필요시 자동 분획수집기를 부착할 수도 있다. 칼럼은 팽윤된 젤과 같은 부드러운 물질 또는 유리, 실리카나 유리 고분자 물질과 같은 단단한 물질로 충전된다. 단단한 물질로 충전된 칼럼은 높은 압력을 발생시키는 펌프 시스템을 사용하기 때문에 신속한 분리에 유리하다. 이동상은 검체종류, 분리매체, 검출방법에 의해 선택된다.

분리를 수행하기에 앞서, 충전제는 의약품 각조의 규정 또는 제조사의 지침에 따라 전처리하여 칼럼에 충전할 수도 있다. 크로마토그래프법은 분리방법에 따라 시스템 적합성을 적절히 평가한다.

혼합물의 상대적 조성 측정 의약품 각조의 규정을 따라 분리과정을 수행한다. 만약, 분석하고자 하는 모든 성분들이 동일한 반응성을 나타내는 물리화학적 특성으로 시료를 분석한다면(예를 들어, 분석하고자 하는 성분들이 동일한 비흡광도(specific absorbance)를 갖고 있다면), 개별 성분의 피크 면적을 모든 성분들의 피크 면적 총합으로 나누어 그 성분의 상대적인 양을 구할 수 있다. 그러나 만약 검출을 위해 사용되는 물리화학적 특성의 농도-반응성이 분석하고자 하는 성분들 간에 같지 않다면, 의약품 각조에 규정된 교정용 표준품을 사용하여 얻은 검량선을 이용하여 함량을 계산한다.

분자량 측정  크기배제 액체크로마토그래프법은 의약품 각조에 규정된 적절한 교정용 표준품과 비교하는 방법으로 분자량을 측정하는데 사용될 수 있다. 이를 위해 우선 교정용 표준품의 분자량 로그값 및 유지용적간 그래프를 그리게 되는데 이 경우 대개 그래프는 배제용적과 총 침투용적 내에서 직선이 되며, 이 검량선을 이용하여 분자량을 결정한다. 이와 같은 분자량 결정에서 유의할 점은 실험조건이나 용질/용매 시스템이 달라진다면 이전 검량선은 더 이상 유효하지 않다는 점이다.

고분자물질의 분자크기에 따른 분포도 측정 크기배제 액체크로마토그래프법은 고분자물질의 분자 크기에 따른 분포도를 측정하는데 사용될 수 있다. 그러나 시료간 비교는 동일한 실험 조건하에서 얻어진 결과에 대해서만 유효하다. 교정에 사용되는 표준품과 고분자물질의 분자크기의 분포도를 측정하는 방법은 의약품 각조의 규정을 따른다.

[별지 4]

69. 펩티드 지도작성법

펩티드 지도작성법은 유전자재조합 단백질의  확인시험에 사용되는 분석법으로 효소적 또는 화학적 방법으로 단백질을 절단하여 얻은 펩티드 조각을 분리하여 확인하는 방법이다. DNA에 암호화되어있는 유전정보의 번역과정이나 돌연변이에 의해 아미노산 서열에 변화가 생길 경우, 단백질 절단에 의해 만들어지는 펩티드 조각에 변화가 생길 수 있다. 따라서 펩티드 지도는 분석단백질의 일차구조상의 변화를 반영하는 일종의 단백질 지문 같은 정보를 제공한다. 이 같은 특성 때문에 펩티드 지도작성법은 제조공정의 일관성이나 유전적 안정성을 입증할 수 있는 비교 분석법으로 활용된다. 펩티드 지도작성 과정에는 의약품에 포함된 단백질의 분리 및 정제, 펩티드 결합의 선택적 절단, 크로마토그래프법을 이용한 펩티드의 분리, 펩티드의 분석 및 확인의 4가지 주요단계가 필요하다. 이 과정에서 시료는 동일하게 처리된 표준물질과 비교분석되는데 특히 정확한 분석을 위해서는 절단 반응이 완전하게 일어나는 것이 중요하다. 보통 화학절단제 보다는 트립신과 같은 효소를 사용할 때 절단이 더 잘 이루어진다. 의미 있는 지도 작성을 위해서는 충분한 수의 펩티드 절단조각이 얻어져야 하지만 절단조각이 너무 많으면 많은 단백질들이 같은 양상을 나타내어 지도의 특이성이 없어질 수도 있다. 따라서 펩티드 지도작성법은 각 단백질이 갖고 있는 고유특성에 대한 이해를 바탕으로 특이성을 충분히 가지도록 개발되어야 한다.

단백질의 분리 및 정제  원료의약품 및 완제의약품을 분석하는 경우, 분석을 방해하는 부형제나 부형단백질이 포함되어 있어 분리와 정제 과정이 필요하다. 필요한 경우 의약품 각조에 규정된 방법에 따라 시험할 수 있다. 또한 필요시 제형으로부터 단백질의 정량적 회수도 확인할 수 있다.

펩티드결합의 선택적 절단  시험할 단백질의 특성에 따라 단백질의 적절한 절단방식을 결정하고, 그 범주 내에서 절단제 종류를 선택한다. 여러 절단제와 이들의 특징은 표 1에 제시되어 있으며 기술 발달에 따라 사용가능한 절단제는 더 추가될 수 있다. 트립신과 같은 절단제를 사용하는 경우 너무 많은 펩티드 조각이 생성된다면 시료 단백질의 리신 잔기를 시트라코닐화나 말레일화시켜야 한다. 이와 같은 시료 전처리 외에 절단제를 전처리해야 하는 경우도 있는데 예를 들어 트립신을 사용할 때, 미량으로 들어 있는 키모트립신으로 인해 펩티드 지도의 재현성이 손상되는 것을 막기 위해 효소저해제(TPCK, tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)를 처리하여 키모트립신을 불활성화시키거나 크로마토그래프법으로 트립신만을 분리하여 사용하기도 한다.

표 1. 펩티드 지도 작성용 절단제
형태	절단제	특이성
효소 절단제	트립신 (EC 3.4.21.4)	아르기닌과 리신 C-말단
	알파키모트립신 (EC 3.4.21.1)	소수성 부위의 C-말단 (예, 리신, 메티오닌, 알라닌, 방향족)
	펩신 (EC 3.4.23.1 및 EC 3.4.23.2)	비특이적 분해
	리신엔도펩티다제 (EC 3.4.21.50)	리신의 C-말단
	글루타민산엔도펩티다제 (EC 3.4.21.19)	L-글루타민산과 아스파라긴산의 C-말단
	펩티딜-아스파라긴산-메탈로엔도펩티다제 (EC 3.4.24.33)	아스파라긴산의 N-말단
	클로스트리페인 (EC 3.4.22.8)	아르기닌의 C-말단
화학 절단제	시안화브롬	메티오닌의 C-말단
	2-니트로-5-티오시아노벤조산	시스틴의 N-말단
	o-요오드벤조산	트립토판과 티로신의 C-말단
	묽은 산	아스파라긴산과 프롤린
	BNPS-스케톨	트립토판

1) 단백질의 전처리  시료를 농축하거나 또는 단백질 제형에 사용된 부형제나 안정제가 펩티드 지도작성에 방해가 된다면 시료로부터 분석할 단백질을 분리하는 것이 필요하며 이를 위한 물리적 전처리 방법으로는 한외여과법, 칼럼크로마토그래프법, 동결건조법 등이 있다. 다른 한편 절단 효소를 처리하기 전에 효소를 절단부위에 충분히 접근시키기 위해 단백질의 접힘을 풀어야 하는데 이를 위해 요소와 같은 수소결합 해리제를 사용하여 디설피드 결합을 환원하거나 알킬화시킨다. 그리고 트립신으로 분해할 경우, 트립신 자체가 자가분해되어 분석에 영향을 주는 피크가 생길 수도 있기 때문에 이를 막기 위해 분해완충액을 이용하여 희석하기 전까지 효소는 자체활성을 위한 최적 pH가 아닌 용액조건(예, 트립신 사용시, pH 5)에서 준비하고, 분해 반응시 트립신과 단백질간 비를 적절히 조절한다.

2) 최적 분해 조건 설정 일반적으로 화학적 또는 효소적 반응에 영향을 줄 수 있는 모든 인자들은 단백질 분해 과정에도 영향을 줄 수 있으므로, 최적 분해 조건 설정은 중요하다.

가) 반응 pH  절단제의 활성을 최적화할 수 있는 분해용액의 pH는 경험적으로 결정한다. 예를 들면, 절단제로 시안화브롬을 사용할 경우에는 pH 2와 같은 강산 조건이 필요하며, 트립신을 사용할 때는 pH 8과 같은 약알칼리성 조건이 최적이다. 또한 일반적으로 최적의 분해를 위해 pH는 반응 중에 일정하게 유지되어야 한다.

나) 반응온도  대부분 분해온도는 25 ∼ 37 ℃ 사이가 적절하지만 분해조건에 맞게 최적온도를 설정할 수 있다. 어떤 단백질들은 반응 온도가 증가하면서 쉽게 변성되기 때문에 시험 단백질의 종류에 따라 적절한 반응온도를 결정하여 화학적 부반응을 최소화하여야 한다. 예를 들면, 유전자재조합 소마트로핀을 고온에서 분해할 경우, 침전되기 때문에 4 ℃에서 실시한다.

다) 반응시간  시료가 충분하다면 재현가능한 펩티드 지도를 얻으면서 불완전분해를 피할 수 있는 최적시간 탐색 연구를 실시한다. 분해시간을 2 ∼ 30 시간으로 변화하면서, 지도작성을 방해하지 않는 산을 첨가하거나 또는 냉동함으로써 반응을 멈추게 할 수 있다.

라) 절단제의 양  과량의 절단제를 사용하여 신속히 분해 (6 ∼ 12 시간) 시키는 경우라도, 그 사용량은 크로마토그래프법의 지도 양상에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 최소화되어야 한다. 일반적으로 단백질 : 단백질 절단제의 비는 20 : 1 ∼ 200 : 1 사이를 사용하는데, 온도 및 반응 시간에 따라 단백질과 절단제의 반응비는 다양하게 설정될 수 있다. 분석 중 간섭현상을 일으킬 수 있는 인위적 분해요소들을 걸러내기 위해, 분해대조액은 시험 단백질을 제외한 모든 성분이 포함된 공시험액을 사용한다.

크로마토그래프법에 의한 분리 분석 단백질 특성에 따라 적절한 지도작성 방법을 선택한다. 펩티드를 성공적으로 분리하는 검증된 방법들은 표 2와 같으며, 아래 내용에서는 주로 역상액체크로마토그래프법에 대해 기술하였다.

표 2. 펩티드 분리 방법

역상액체크로마토그래프법

이온교환크로마토그래프법

소수성크로마토그래프법

폴리아크릴아미드겔 전기영동법(비환원성)

도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동법

모세관전기영동법

고전압종이크로마토그래프법

고전압종이전기영동법

용매와 이동상의 순도는 액체크로마토그래프법을 이용한 분리시 매우 중요한 요소이다. 필요시 액체크로마토그래프법에 사용되는 전용 용매와 정제수를 구입해서 사용할 수 있다. 단일 용매보다 혼합 용매 사용시, 용존 기체는 농도기울기 분리에서 문제가 발생될 수 있으므로 필요한 경우, 탈기(예, 진공처리, 초음파처리)하여 사용한다. 용매 내 고형물도 액체크로마토그래프 장치에 유입되면 펌프밸브의 봉합부위에 손상을 주거나 칼럼을 막을 수 있으므로, 여과과정이 필요하다.

1) 칼럼  크로마토그래프용 칼럼은 단백질 특성에 따라 적절하게 선  택한다. 예를 들면 실리카겔로 100 ∼ 300 Å 공극 크기를 가진 칼럼이 분리에 가장 좋고, 소형 펩티드에는 입자경이 3 ∼ 10 μm인 옥틸실릴화실리카겔칼럼 (C8)과 입자경이 1.7 ∼ 10 μm인 옥타데실릴화실리카겔칼럼(C18)이 입자경이 5 ∼ 10 μm인 부틸실릴화실리카겔칼럼 (C4)보다 더 효율적이다.

2) 용매  가장 널리 사용되는 유기용매는 아세토니트릴과 정제수 혼합액에 0.1 % 이하의 트리플루오로아세트산이 첨가된 용매이다. 단백질 분해물의 점도를 크게 증가시키지 않는다면 용해도를 높이기 위해 필요시 이소프로판올 또는 n-프로판올을 첨가할 수 있다.

3) 이동상  인산염을 포함하는 이동상은 pH 조건을 선택하는데 있어서 유연성을 제공한다. pH 3.0 ∼ 5.0 범위에서의 변화는 글루타민산과 아스파라긴산 등의 산기를 포함한 펩티드의 분리능을 증진시킬 수 있다. pH 2 ∼ 7 (중합체 기반 충전제의 경우 더 높은 pH) 사이의 인산나트륨과 인산칼륨, 아세트산암모늄, 인산 등은 아세토니트릴을 이용한 용매기울기 분리 조건에서 함께 사용되며, 트리플루오로아세트산이 함유된 아세트니트릴이 자주 사용되고 있다.

4) 용매기울기에 의한 분리  용매기울기에는 선형, 비선형 등이 포함된다. 복잡한 혼합물을 분리하기 위해서는 기울기가 완만한 것이 좋다. 기울기는 시료의 지표 피크가 될 1 개 또는 2 개의 피크가 명확히 분리되도록 최적화되어야 한다.

5) 단일용매에 의한 분리  한 개의 이동상을 사용하는 액체크로마토그래프법은 사용이 편리하고 검출 감도가 높다. 그러나 때로는 각 피크를 명확히 분리하기 위한 이동상의 최적 조성을 얻기가 어렵다. 이동상의 조성비 또는 pH의 작은 변화에도 펩티드 피크의 머무름시간에 심각한 영향을 준다면 단일용매법을 사용하지 말아야 한다.

6) 기타 인자들  칼럼의 온도 조절은 좋은 재현성을 위하여 반드시 필요하다. 이동상의 유속은 0.05 〜 2.0 mL/분 정도이며, 200 〜 230 nm에서 자외부 검출기로 펩티드를 검출한다. 그 밖에 칼럼 후 유도체화 등과 같은 여러 검출 방법들이 있지만 자외선 검출만큼 재현성이 있거나 다목적성을 갖고 있지는 않다.

7) 시스템 적합성  이는 시험방법을 전반적으로 평가하는 것이다.   시스템 적합성의 판정기준은 시험결과물 해석과 판정에 영향을 주는 주요 시험인자들을 규명하는데 달려있으며, 이러한 주요인자들은 펩티드 분해와 분석을 검증하는 기준이 된다. 원하는 분해종말점에 도달되었는지 여부의 지표는 시료 단백질과 동일한 방식으로 처리한 표준품과 비교하면 확인할 수 있다. 따라서 시료 단백질과 병행하여 표준품을 사용하는 것은 시스템 적합성 한도를 만들고 설정하는데 필수적이며, 추가 비교를 위해 표준품의 크로마토그램이 포함되어야 한다. 펩티드 분석을 위한 주요 시스템적합성 인자는 특정 펩티드 분리 및 검출 방식과 자료분석 요건에 달려있다.

펩티드 지도작성법이 확인시험에 사용될 때 확인된 펩티드의 시스템 적합성 판정요건은 선택성과 정밀성이다. 이 경우 변이단백질의 확인시험을 하고자 할 때, 단백질 표준품의 펩티드 지도와 비교하여 펩티드 지도상의 펩티드 조각들의 일차구조를 확인하는 것은 이미 알고 있는 일차구조에 대한 검증과 변이단백질에 대한 정보를 제공한다. 펩티드 분리도를 결정하기 위해 분해된 표준시료를 사용하는 것도 하나의 방법이다. 변이단백질 분석을 위해 변이펩티드가 펩티드 지도상에서 잘 분리되지 않는 지점에 위치한다면 특성화된 변이체 혼합물과 표준품을 사용한다. 펩티드 양상의 일관성 지표는 검출된 주 펩티드 피크의 수를 사용할 수 있다. 펩티드 양상의 일관성은 펩티드 피크들의 분리도로 가장 잘 정의될 수 있다. 피크 간 분리, 최대 피크의 너비, 피크면적, 피크꼬리인자, 칼럼효율성 등의 크로마토그래프법 인자들은 펩티드 분리도를 정의하는데 사용된다. 시험 단백질과 사용되는 분리 방법에 따라 한 개 또는 여러 개 펩티드의 분리 요건이 필요하다.

표준물질 분해물을 반복 분석하여 정밀성과 정량적 회수율을 측정할 수 있다. 확인된 펩티드의 회수율은 일반적으로 펩티드 표준품을 사용하여 평가할 수 있으며, 정밀성은 상대표준편차로 표현한다. 확인된 펩티드의 회수율과 정밀성에 차이가 발생할 것으로 예상되므로, 이에 대한 시스템적합성 기준은 설정되어야 한다. 이러한 기준들은 각 단백질마다 다르므로 의약품 각조에 규정될 것이다.

시스템 적합성을 위한 상대 머무름시간, 피크면적 또는 피크높이와 같은 피크반응, 피크 수 및 전반적 유출 양상 등은 초기 육안 비교로 확인될 수 있고 이는 피크반응 비의 수학적 분석이나 시료 분해물과 표준물질 분해물의 1 : 1(V/V) 혼합물의 크로마토그래프 양상을 통해 보완될 수 있다. 만약 시료 분해물과 표준물질 분해물에 있는 모든 피크들이 상대적으로 동일한 머무름과 피크 반응 비를 보인다면 시료의 동정은 확인된 것이다.

만약 피크들이 초기에 상당히 다른 상대 머무름 시간에서 유출되었다가 1 : 1 혼합물에서 하나의 피크로 관찰된다면 이는 시스템 변동을 보여주는 것이다. 그러나 1 : 1 혼합물에서 여러 피크들이 관찰된다면 이는 각 피크의 펩티드들이 동일하지 않다는 것을 보여준다. 만약 1 : 1 혼합물에서 피크가 시료 분해물이나 표준물질 분해물의 해당 피크보다 확연히 넓어졌다면 서로 다른 펩티드들이 존재하는 것이다. 펩티드 지도 결과 분석은 컴퓨터에 기반한 소프트웨어가 이용되고 있으며 그 외에도 자동화 방식인 수리공식, 모델 및 양상 인식 등이 사용되고 있는데, 그 예로서 적외부 흡광분석법에 의한 자동확인이나 펩티드 확인을 위한 다이오드어레이 자외가시부 흡광도측정법의 응용 등이 있다. 그러나 이러한 방법들도 부적절한 분리, 펩티드 조각의 동시 유출, 또는 시료 분해물과 표준물질 분해물 사이의 절대 피크반응의 차이라는 한계를 갖고 있다.

머무름시간, 피크면적 또는 피크높이들의 산술적 비교는 선택된 해당 피크들 그룹의 펩티드 지도의 정확한 확인을 위해 사용될 수 있다. 피크면적은 변화가 가장 작은 하나의 피크를 내부표준물질로 하여 산출할 수 있는데, 피크면적의 적분은 기준선 변화에 쉽게 영향을 받기 때문에 분석오류가 생길 수 있다는 것을 고려해야 한다. 그렇지 않으면 시료에 대해 모든 피크높이들의 합에 대한 각 펩티드 피크높이의 백분율로 산출할 수도 있는데, 이 백분율은 표준물질의 해당 피크의 백분율과 비교한다. 트립신 절단제의 자가분해 가능성 확인은 공시험액을 트립신 처리하여 얻은 펩티드 지도 결과로 알 수 있다.

펩티드 지도작성법의 적격성에 대한 최소 요건은 대조시험으로서 시스템 적합성을 포함하는 승인된 시험법을 따르는 것이다. 일반적으로 초기 규제과정에서는 단백질의 펩티드 지도작성법의 적격성을 평가하는 것으로도 충분하다. 그러나 허가승인과정이 진행되면, 적격성 평가에 추가적으로, 단백질에 대한 펩티드 지도작성법 개발이 의도된 대로 실행되는지를 보증해 줄 수 있는 부분 밸리데이션이 포함되어야 한다.

펩티드 조각의 확인  펩티드 지도작성법을 정성분석으로 사용할 때  에는 각 펩티드 피크들의 완전한 규명이 필요하지 않다. 그러나 허가심사시 요구되는 시험법 검증을 위해서는 펩티드 개별 피크들에 대한 정확한 특성분석이 필요하다. 펩티드 피크의 특성분석법에는 N-말단 서열분석법, 질량분석법 등이 있다. 특성분석 목적으로 N-말단 서열분석법을 사용할 때에는 분리 분석 규모를 확대하게 되는데 이 경우 펩티드 피크들의 분리도에 영향을 줄 수 있기 때문에 규모 확대가 분리도에 영향을 주지 않았음을 입증해야 한다.  N-말단 서열분석을 위한 시료는 각 펩티드 피크의 유출액을 모아서 진공농축을 하여 제조하는데, 필요하다면 이를 다시 크로마토그래프법으로 분리하기도 한다. N-말단 서열분석에서 펩티드 조각의 아미노산 분석은 보통 펩티드 크기에 의해 제한을 받는다. 다른 한편 만일 N-말단이 차단되어 있다면 서열분석 전에 이를 제거하여야 한다.  카르복시펩티다제와 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석기가 조합된 펩티드의 C-말단 서열분석법도 단백질 특성분석에 사용될 수 있다. 질량분석기를 사용한 펩티드 조각의 특성분석에서 분리된 펩티드 시료는 직접 또는 크로마토그래피 장치와 기계적으로 연계되어 구조분석용 질량분석기로 주입된다. 탠덤 질량분석법 (Tandem MS)은 변이단백질의 서열을 분석하여 아미노산 변이 형태를 알아내는데 사용된다. 또한 환원 전후의 분해물 질량스펙트럼을 비교해보면 여러 펩티드에 있는 디설피드결합의 위치를 확인할 수 있다.

만약 사용한 펩티드 지도분석으로 단백질 일차구조의 특정 영역을 알아낼 수 없다면 이차 펩티드 지도를 만들 필요가 있다. 펩티드 지도작성을 통한 단백질 특성분석의 목표는 단백질 일차구조의 95 % 이상을 규명하는 것이다.

[별지 5]

70. 폴리아크릴아미드겔 전기영동법

폴리아크릴아미드겔 전기영동법 (PAGE)은 생물학적제제 내 단백질의 정성적 분석이나 단백질 순도를 위한 정량적 분석에 사용된다. 전기영동 분석은 의약품 내 단백질의 동질성을 확인하고 평가하는데 적합한 방법이다. 이 방법은 정제된 단백질의 분자량을 측정하거나 혼합되어 있는 단백질의 조성을 결정하는데 널리 사용된다. 곧바로 사용할 수 있는 겔과 시약들이 널리 판매되고 있으며, 시험의 유효성 요건을 충족하고 동일한 결과를 얻을 수 있다면, 여기에서 언급된 것들을 대체하여 사용할 수 있다.

전기영동법은 전기장 하에서 전하를 가진 물질이 반대 전하를 갖고 있는 전극으로 이동하는 원리를 이용한다. 겔 전기영동법에서 입자는 분자여과 작용을 하는 겔 매트릭스와의 상호작용에 의하여 이동이 저지된다. 전기력에 의한 분자여과라는 대립 작용에 의해 입자의 크기, 모양 및 전하의 종류에 따라, 겔에서의 이동 속도는 달라진다. 이러한 물리화학적 특성들의 차이로 인해 혼합물 내 거대분자들이 전기영동시 다른 속도로 이동하여 분리된다.

폴리아크릴아미드겔의 특성들

폴리아크릴아미드겔의 여과 특성은 양기능성 비스아크릴아미드가 폴리아크릴아미드 사슬과 교차결합할 때, 삼차원적 섬유망이 형성되면서 공극이 만들어진다. 이러한 중합현상은 과황산암모늄과 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (테메드)에 의해 촉매된다.

겔의 아크릴아미드 농도가 증가하면 형성된 겔의 공극 크기는 감소한다. 겔의 공극 크기는 겔의 여과특성을 변화시켜 겔에서의 단백질의 이동성을 결정한다. 겔의 농도가 높으면 겔이 쉽게 부서져서 다루기 힘들고, 공극 크기가 작아져 단백질이 겔을 통해 이동하는 속도가 느려지기 때문에, 사용할 수 있는 아크릴아미드의 농도에는 한계가 있다. 따라서 분석하고자 하는 단백질에 대한 분리가 최적화 될 수 있도록 적절한 아크릴아미드 농도 조절을 통해 겔의 공극 크기를 결정하며, 아크릴아미드와 비스아크릴아미드 각각의 조성 변화가 이러한 사용되는 겔의 물리적 특성을 반영한다.

겔의 조성과 더불어 단백질의 상태도 전기영동에서 단백질 이동에 중요한 요소이다. 단백질의 전기영동 상에서의 이동은 전하를 띤 기들의 해리상수 (pK)값과 분자크기에 따라 결정된다. 또한 완충액의 종류, 농도, pH, 온도, 전기장의 세기, 지지체의 특성에 의해서도 영향을 받는다.

변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동

이 방법은 분자량이 14000 〜 100000의 범위의 단백질 분석에서 주로 사용되지만, 농도기울기 겔이나 특정 완충액 시스템 등 다양한 기법을 이용하면 분자량 범위를 넓힐 수 있다.

변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동법은 단백질을 겔에 주입하기 전, 단백질 응집을 최소화하기 위해 강한 음이온 계면활성제 (Detergent)인 도데실황산나트륨과 함께 가열하는 방법으로 단백질의약품의 품질평가에 가장 흔히 사용되는 전기영동 방법이다.

이렇게 변성된 단백질들은 도데실황산나트륨과 결합하여 음전하를 띠게 되며 단백질 형태와 관계없이 일정한 전하 대 질량비를 나타낸다. 단백질과 결합하는 도데실황산나트륨 양은 분자량에 비례하며 아미노산 서열과는 무관하기 때문에, 도데실황산나트륨-단백질 복합체는 폴리아크릴아미드겔 상에서 단백질의 크기에 따라 이동하게 된다.

전기영동에서 도데실황산나트륨-단백질 복합체는 분자량에 대해 반비례하여 이동하는 것으로 가정한다. 따라서 도데실황산나트륨-단백질 복합체 중 작은 것은 큰 것보다 빠르게 음극으로 이동한다. 이에 따라 보정용 폴리아크릴아미드겔에서의 상대적 이동 거리로부터 각 단백질 분자량의 측정이 가능하며, 분리된 각 단백질 밴드로 순도를 측정할 수 있다.

그러나 단백질에 N- 또는 O-당화가 된 경우, 단백질 분자량 측정에 중대한 영향을 미치게 된다. 왜냐하면 당단백질의 당질화 부위에는 일정한 전하 대 질량비로 도데실황산나트륨이 붙지 않기 때문이다. 따라서 번역 후 (post-translational) 변형된 (modified) 단백질의 분자량은 반드시 폴리펩티드 사슬의 분자량과 일치하지는 않는다.

환원 조건

단백질은 디설피드결합에 의해 그 형태가 유지되기도 한다. 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 (DTT) 환원제로 처리하면 단백질의 삼차구조가 풀리면서 도데실황산나트륨과 결합하게 된다. 이러한 조건하에서 단백질들의 분자량은 적절한 분자량 표준품의 존재 하에서 선형회귀분석을 적용하여 산출할 수 있다.

비환원 조건

경우에 따라 단백질을 환원조건으로 분석하는 것이 바람직하지 않을 때도 있다. 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 같은 환원제로 처리하지 않으면, 디설피드결합이 그대로 보존되어 단백질의 삼차구조가 유지된다. 더욱이 비환원 단백질은 도데실황산나트륨으로 완전히 포화되지 않기 때문에, 일정한 질량비로 도데실황산나트륨이 결합하지 않는다.

분자량 표준품과 검체가 유효 분석을 위한 유사 구조를 갖고 있어야하기 때문에, 환원 조건으로 분석하는 것보다 단백질 분자량이 덜 정확할 수 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 조건의 겔에서 분리된 밴드를 통해 분석하고자 하는 단백질의 순도를 측정할 수 있다.

불연속완충액시스템의 전기영동

두 개의 인접한 서로 다른 겔, 즉 위쪽 압축겔과 아래쪽 분리겔로 이루어진 불연속완충시스템의 전기영동법이 단백질 혼합물의 분석에서 가장 많이 사용한다. 두 개의 겔은 서로 다른 공극 크기, pH, 이온강도로 이루어진다. 또한 두 겔과 전기영동 완충액에 다른 이동성 이온들이 사용된다. 이러한 완충액의 불연속성은 많은 용량의 검체를 압축겔에 농축하여 분리도를 높여준다. 전기를 흘려주면  검체 사이로 전압강하가 형성되면서 단백질이 압축겔로 이동하고 그 뒤를 따라 전기영동 완충액의 글리신염이 압축겔로 이동한다. 앞쪽에 빠르게 이동하는 염화이온과 뒤쪽에 비교적 느리게 이동하는 글리신염 이온으로 만들어진 이동 경계지역이 형성된다. 이렇게 앞과 뒤에 위치한 이온들 사이에 형성된 높은  전압 차의 이동 경계지역을 단백질이 이동하게 된다. 이로 인해 검체의 주입량에 상관없이 모든 단백질은 좁은 영역에 농축되어 분리겔로 들어가게 된다. 공극이 큰 압축겔은 대부분 단백질의 이동을 방해하지 않으며 단백질이 퍼지는 것을 막아주는 역할을 한다. 압축겔과 분리겔 사이의 경계면에서 단백질은 분리 겔의 제한적 공극 크기 때문에 이동 방해를 받게 된다. 그리고 분리겔에 들어오면 단백질의 이동은 겔 매체의 상대적으로 작은 공극 크기에 의해 더욱 느려지게 된다. 그러나 글리신염 이온은 트리스히드록시메틸아미노메탄과 글리신염에 의해 형성된 균일한 pH 영역에서 이동하여 단백질보다 빠르게 이동하게 된다. 분리겔은 단백질이 분자량에 따라 분리될 수 있게 해준다.

불연속수직완충 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 제조

겔 농축 용액

30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액  아크릴아미드 290 g과 메틸렌비스아크릴아미드 10 g을 온수 1 L에 녹인 용액을 만들어 여과한다. [아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드는 저장하는 동안 각각 아크릴산과 비스아크릴산으로 변하는데, 이러한 탈아민반응은 빛과 알칼리에 의하여 촉매된다. 따라서 이 용액의 pH는 7.0 또는 그 이하이어야 하며, 차광한 용기에 넣어 냉장 보관한다. 장기간 보관하지 않는다.]

과황산암모늄 용액  물 1 L 당 100 g의 과황산암모늄 용액을 소량 만들어 4 ℃에서 보관한다. [과황산암모늄은 아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드를 중합시키는 유리기를 제공하며, 빨리 분해되기 때문에 장기간 보관하지 않는다.]

테메드(N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민) (TEMED) 전기영동에 적합한 것을 사용한다. [테메드는 과황산암모늄으로부터 유리기가 형성되는 것을 촉매하면서 아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드의 중합을 촉진시킨다. 테메드는 유리염기로만 작용하기 때문에 낮은 pH에서는 중합반응이 저해된다.]

도데실황산나트륨 용액  물 1 L당 100 g의 도데실황산나트륨 (전기영동법에 적합) 용액을 만들어서 실온에 보관한다.

1.5 mol/L 트리스완충액  트리스히드록시메틸아미노메탄 약 90.8 g을 500 mL 플라스크에 넣어 물 400 mL에 녹이고, 염산으로 pH 8.8로 맞춘 후 물을 첨가하여 희석한다.

1 mol/L 트리스완충액  트리스히드록시메틸아미노메탄 약 60.6 g을 500 mL 플라스크에 넣고 400 mL 물에 녹이고, 염산으로 pH 6.8로 맞춘 후 물을 첨가하여 희석한다.

겔판 준비

두 개의 유리판 (예, 10 cm x 8 cm), 콤 (Comb), 두 개의 간격판, 주형틀을 부드러운 세제로 닦고, 물로 깨끗이 세척한 후, 종이타월 또는 티슈로 닦아서 말린다.

두 개의 간격판을 두 개의 유리판 사이의 짧은 면을 따라 끼운다. 유리판과 간격판을 손으로 누르면서 조임쇠를 각각 끼워 고정한다. 겔을 부어 넣을 준비가 되도록 조임쇠가 없는 긴 면을 겔 주형틀의 밑부분에 고정하여 겔 주형을 만든다.

겔 준비

불연속완충 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔에서는 분리겔과 압축겔의 아크릴아미드-비스아크릴아미드의 조성, 완충액, pH가 다르기 때문에, 분리겔을 먼저 부어 굳히고 압축겔을 부어야 한다.

분리겔 (Resolving Gel)

삼각플라스크에 표 1과 같이 원하는 농도의 아크릴아미드 용액을 필요한 양만큼 준비한다. 주어진 순서대로 성분들을 섞되, 필요시 과황산암모늄 용액과 테메드 용액을 첨가하기 전에 용액에 기포가 생기지 않을 때까지 진공을 걸어준다. 표 1과 같이 과황산암모늄 용액과 테메드 적당량을 첨가하여 흔들고, 준비된 겔판 사이 공간에 즉시 붓는다. 이 때 콤 이빨 길이 1 cm 정도를 포함하여, 압축겔을 위한 충분한 공간을 남겨둔다. 이 후, 수분으로 포화시킨 이소부탄올을 분리겔 용액위에 조심스럽게 부어주고, 겔이 실온에서 중합되도록 한다. 약 30 분 후 중합이 끝나면 이소부탄올을 버리고 분리겔 위쪽을 물로 여러 번 씻어서 이소부탄올과 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거한다. 세척 후, 종이타월로 분리겔에 남아있는 용액을 제거한다.

압축겔 (Stacking Gel)

삼각플라스크에 표 2와 같이 원하는 농도의 아크릴아미드 용액을 필요량만큼 준비한다. 필요시 과황산암모늄 용액과 테메드 용액을 첨가하기 전에 용액에 기포가 생기지 않을 때까지 진공을 걸어준다. 표 2와 같이 과황산암모늄 용액과 테메드를 적정량 첨가한 후 즉시 분리겔 위에 붓고, 깨끗한 콤을 압축겔 용액에 기포가 생기지 않도록 조심해서 끼운다. 끼운 콤의 빈 공간을 압축겔 용액으로 완전히 메운다. 겔을 실온에서 중합하도록 한다.

전기영동 분리

검체완충액 1 – 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 염산으로 pH를 6.8로 조정하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다. 검체완충액 1은 사용하기 직전에 검체와 같은 양으로 일대 일로 섞어 사용한다.

검체완충액 2 (환원 조건) - 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 환원시약인 2-메르캅토에탄올 12.5 mL을 첨가한다. 염산으로 pH를 6.8로 조정하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다. 2-메르캅토에탄올 대신에 다른 환원시약인 디티오트레이톨을 사용해야 할 경우에는 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 최종적으로 디티오트레이톨 농도가 100 mmol/L이 되도록 미리 첨가하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다.

전기영동 완충액 - 트리스히드록시메틸아미노메탄 151.4 g, 글리신 721.0 g, 도데실황산나트륨 50.0 g을 물에 충분히 녹인 후 물을 더해 5 L로 만들어서 전기영동 완충액 10 배 원액을 만든다. 사용하기 직전 이 원액을 물로 10 배 희석하고 pH를 8.1 ∼ 8.8로 맞춘다.

실험방법

압축겔이 중합이 끝나 충분히 굳으면, 압축겔에 검체가 들어갈 틈을 만들기 위해 넣었던 콤을 조심스럽게 제거한다. 생성된 틈은 즉시 물이나 전기영동 완충액으로 세척하여 남아있을 수 있는 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거한다. 필요시 주사바늘로 그 틈을 정돈해 준다. 겔판을 전기영동 장치에 조심스럽게 장착한다.

표 1. 분리겔 준비
	조성 용량 (mL) / 겔용량
용액 조성	5 mL	10 mL	15 mL	20 mL	25 mL	30 mL	40 mL	50 mL
6 % 폴리아크릴아미드겔
물	2.6	5.3	7.9	10.6	13.2	15.9	21.2	26.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	8.0	10.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	7.5	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
테메드	0.004	0.008	0.012	0.016	0.02	0.024	0.032	0.04
8 % 아크릴아미드
물	2.3	4.6	6.9	9.3	11.5	13.9	18.5	23.2
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.3	2.7	4.0	5.3	6.7	8.0	10.7	13.3
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.003	0.006	0.006	0.012	0.015	0.018	0.024	0.03
10 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.9	4.0	5.9	7.9	9.9	11.9	15.9	19.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.7	3.3	5.0	6.7	8.3	10.0	13.3	16.7
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
12 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.6	3.3	4.9	6.6	8.2	9.9	13.2	16.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	16.0	20.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
14 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.4	2.7	3.9	5.3	6.0	8.0	10.6	13.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.3	4.6	7.0	9.3	11.6	13.9	18.6	23.2
1.5 mol/L 트리스완충액	1.2	2.5	3.6	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
15 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.1	2.3	3.4	4.6	5.7	6.9	9.2	11.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5	15.0	20.0	25.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2..5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02

표 2. 압축겔 준비
	조성 용량 (mL) / 겔용량
용액 조성	1 mL	2 mL	3 mL	4 mL	5 mL	6 mL	8 mL	10 mL
물	0.68	1.4	2.1	2.7	3.4	4.1	5.5	6.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	0.17	0.33	0.5	0.67	0.83	1.0	1.3	1.7
1 mol/L 트리스완충액	0.13	0.25	0.38	0.5	0.63	0.75	1.0	1.25
도데실황산나트륨 용액	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06	0.08	0.1
과황산암모늄 용액	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06	0.08	0.1
테메드	0.001	0.002	0.003	0.004	0.005	0.006	0.008	0.01

겔을 전기영동장치에 올려놓고, 전기영동 완충액을 위쪽과 아래쪽 탱크에 채운다. 압축겔의 검체 틈 사이의 기포들은 구부러진 주사바늘로 제거해준다. 압축겔의 완충효과가 없어질 수가 있기 때문에, 압축겔에 검체를 주입하기 전에는 예비 전기이동을 하지 않는다. 검체를 주입하기 전에 압축겔을 전기영동 완충액으로 조심스럽게 씻어준다.

위의 시약제조 부분에 명시된 방법에 따라 만들어진 검체완충액으로 검체를 일대 일로 섞어서 시험액을 만들고 표준품도 같은 방법으로 만든다. 압축겔에 검체와 표준품 적당량을 주입한다. 전기영동 제조사마다 기기 사용방식이 차이가 있으므로, 제조사에서 제시한 방법으로 조건을 맞추어 실험 목적에 맞게 전기영동을 실행한다. 단백질 분리의 최적 조건은 전기영동을 실시할 때 시간과 전압이 제조사에서 제시한 것과 달라질 수도 있다. 전기영동의 실시간 진행사항은 염료의 이동 상태를 통해 알 수 있다. 이 때 염료가 분리겔로 이동을 잘하는지 확인하고, 염료가 겔의 하단에 도달하면 전기영동을 멈춘다. 겔을 전기영동장치로부터 분리하여 압축겔을 잘라 버린 후 단백질 염색작업을 한다.

단백질검출

쿠마시 염색은 가장 많이 사용되는 단백질 염색법으로 밴드 당 1 〜 10 μg 정도까지 단백질 양을 확인할 수 있다. 은염색은 밴드 안의 단백질양이 10 〜 100 ng 정도까지 검출할 수 있는 훨씬 민감한 염색법이다.

모든 염색 단계는 회전 교반기 위에서 천천히 실온에서 교반한다. 염색 시 손이 염색될 수 있으므로 장갑을 착용한다.

시약

쿠마시염색액 - 물․메탄올․초고순도아세트산혼합액(5 : 4 : 1)을 섞은 용액 1 L에 1.25 g의 쿠마시브릴리안트블루 R-250을 용해한 다음 여과지로 여과하고 실온에서 보관한다.

탈색액 -  물․메탄올․초고순도아세트산혼합액(5 : 4 : 1)

고정액 I - 물․메탄올․트리클로로아세트산혼합액(5 : 4 : 1)

고정액 II - 메탄올 250 mL을 500 mL 플라스크에 넣고 포름알데히드 0.27 mL를 첨가한 후 물로 희석하여 500 mL로 용량을 맞춘다.

질산은액 - 1 mol/L 수산화나트륨용액 40 mL과 암모니아수 3 mL의 혼합액에 200 g/L의 질산은 용액 8 mL를 교반하면서 한 방울씩 첨가한 후 물을 가하여 200 mL가 되게 만든다.

현상액 - 2 % 시트르산 용액 2.5 mL과 포름알데히드 0.27 mL을 물로 희석하여 500 mL을 만든다.

정지액 - 10 % 아세트산

쿠마시염색

겔을 충분히 담글 수 있을 만큼의 양의 쿠마시 염색액에 넣고 1시간 이상  교반한 후 쿠마시 염색액을 제거한다. 그리고 충분한 양의 탈색액으로 교반기에서 천천히 겔을 탈색시킨다. 염색된 단백질 밴드가 투명한 배경으로부터 분명히 구분되어 보일 때까지 탈색액을 여러 번 바꾸면서 탈색시킨다. 겔이 잘 탈색되면, 검출 감도가 높아져 소량의 단백질 까지 확인할 수 있다. 음이온교환수지나 작은 스펀지를 탈색액에 조금 넣으면, 탈색을 빨리 진행시킬 수 있다. 이 과정에서 사용되는 산-알코올 용액들은 겔 안의 단백질을 완전히 고정하지 않기 때문에, 얇은 겔 상에 있는 저분자 단백질들이 탈색할 때 소실 될 수 있다. 그러나 고정액 I에 1시간 정도 먼저 처리한 다음 겔을 쿠마시염색액에 넣어 염색하면 탈색할 때 저분자 단백질들의 소실을 막을 수 있다.

은염색

겔을 충분히 적실 수 있는 정도의 양의 고정액 II를 준비하여 1시간 정도 천천히 교반한 후, 고정액 II를 제거하고, 새로운 고정액 II를 넣어 1시간 이상 또는 하룻밤 처리한다. 고정액 II를 버리고 겔을 충분한 양의 물로 1시간 동안 교반한다. 겔을 1 % 글루타르알데히드 용액에 15분간 담근 후, 충분한 양의 물로 15분씩 교반하면서 두 번 세척한다. 겔은 질산은액에 15분간 담근 후, 충분한 양의 물로 5분씩 세 번 교반하여 세척한다. 질산은액은 암실에서 실험 할 때마다 새로 만들어야 한다. 겔을 현상액에 약 1분간 현상하여 단백질 밴드가 잘 확인될 정도가 되면, 과하게 현상되는 것을 막기 위해서, 정지액에 겔을 15분간 교반한 다음 정지액을 버리고 물로 다시 교반한다.

겔건조

겔은 염색방식에 따라 다른 건조방법을 사용한다. 쿠마시 염색을 한 경우 탈색 후 겔을 100 g/L 글리세린 용액에 2 시간 이상 처리하고, 은염색을 한 경우는 100 g/L  글리세린 용액에 2 시간 이상 처리한 이후, 20 g/L 글리세린 용액에 5분간 처리하는 세척과정을 추가한다.

두 장의 다공성 셀룰로오스 필름을 물에 5 〜 10분간 담근 후, 이 중 한 장을 건조대에 올려놓고 조심스럽게 겔을 들어 셀룰로오스 필름 위에 올려놓는다. 포집된 기포를 제거한 후 겔 바깥쪽 주변에 적당한 양의 물을 부어 기포가 생기지 않도록 막는다. 두 번째 셀룰로오스 필름을 올려놓고 포집된 기포를 제거한다. 건조 틀 조립을 마치면 건조될 때까지 실온에 둔다.

분자량 결정

단백질의 분자량은 이미 알려진 분자량을 가진 지표 단백질들의 이동거리와 비교해서 결정한다. 사용되는 지표 단백질들은 분자량을 정확히 알고 있는 단백질 혼합물이어야 하고 염색이 균일하게 되어야 한다. 다양한 범위의 분자량 지표 단백질들을 포함하고 있는 지표단백질 농축 원액을 적절한 검체완충액에 희석하고 시험 검체와 함께 같은 겔에 부하한다.

염색 후 단백질 밴드 (지표 또는 검체 단백질)의 분리겔 위로부터의 이동 거리를 재서, 브로모페놀블루 염료의 위치를 확인하여 염료의 브로모페놀블루 이동 거리로 나눈다. 이렇게 얻어진 표준화된 이동거리를 브로모페놀블루 염료에 대한 상대적인 단백질의 상대이동도라고 하며, Rf 수치라고 부른다. Rf 수치 대비 지표 단백질의 분자량 (MR)의 로그 그래프를 만드는데, 약간 S자형이 될 수도 있다. 미지의 단백질 수치가 그래프 상의 직선상에 위치한다면 Rf에 대한 log MR 커브로부터 선형 외삽 회귀분석법으로 미지의 분자량을 측정할 수 있다.

유효성 검증

분자량 지표 단백질들 중 가장 작은 크기의 단백질이 겔 전체 길이의 80 % 이내로 전개되거나, 의약품 단백질과 의약품 단백질의 이량체 또는 의약품 단백질에서 유래한 유연불순물들이 서로 분리되지 않았다면 그 시험은 유효하지 않다.

각 단백질의 상대이동도 Rf와 로그 분자량 사이에 선형 관계를 이루면서 각 단백질 간의 분리가 나타난다. 추가적인 검증 요구사항들은 각 의약품 각조에 명시되어 있다.

불순물의 정량

의약품각조에 불순물 단백질 한도가 규정되어 있는 경우, 해당 검체액을 희석하여 불순물 단백질 한도 측정용 표준액을 만들어야 한다. 예를 들어 불순물 단백질 함량이 의약품 단백질 함량의 5 %가 기준이라면, 의약품 단백질 검체액을 희석액으로 1 : 19 비율로 희석하여, 5 % 함량 기준의 불순물 단백질 한도 측정용 표준액을 만들어서 사용해야 한다. 전기영동 결과, 검체액에서 주 밴드 이외에는 어떤 불순물 밴드도 5 % 함량 표준액에서 얻어진 밴드보다 더 커서는 안 된다. 검증된 조건하에서 밀도측정기를 사용, 주 밴드의 밀도값을 기준으로 불순물의 밀도값을 상대화함으로서 불순물의 양을 측정할 수 있다.

부  칙

제1조(시행일) 이 고시는 고시 후 3개월이 경과한 날부터 시행한다.

제2조(시험법 변경에 따른 경과조치) 별표 3 의약품각조 제1부 중 시험법이 변경된 품목에 대하여는 종전 규정의 시험법을 선택하여 사용할 수 있다.

신구조문 대비표

현     행

개  정  안

결정글루코사민황산염

Crystallized Glucosamine Sulfate

확인시험

◦ 용액 (I) : 물 150 mL에 아세트산(100) 3 mL를 넣고 요오드화칼륨 1 g, o-톨리딘 100 g을 녹여 여과한 액

결정글루코사민황산염

Crystallized Glucosamine Sulfate

확인시험

◦ -------------------------------------------------------------- 100 mg---------------

글루타민

Glutamine

확인시험

7) 유연물질  (전단 생략) 검액 및 표준액 5 μL씩을 박층크로마토그래프용실리카겔을 써서 만든 박층판에 점적하고 1-부탄올·물·아세트산(100)혼합액(3 : 1 : 1)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 다음 박층판을 80 ℃에서 30 분간 가열하여 말린다. 여기에 닌히드린의 메탄올·아세트산(100)혼합액(97 : 3) (1 → 100)을 고르게 뿌린 다음 80 ℃에서 10 분간 가열할 때 검액에서 얻은 주반점 이외의 반점은 표준액에서 얻은 반점보다 진하지 않다 (0.5 % 이하).

글루타민

Glutamine

확인시험

7) 유연물질  (현행과 같음) ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 0.2 ---.

L-글루탐산나트륨수화물

Sodium L-Glutamate Hydrate

0.1mol/L 과염소산 1 mL = 16.911 mg C5H8O4NNa

L-글루탐산나트륨수화물

Sodium L-Glutamate Hydrate

---------------- 8.455 --------

----------

데소니드

Desonide

흡 광 도  [eqn: rm E` _{1cm} ^{1%}] (242 nm) : 350 ∼ 370 (건조한 다음 30 mg, 메탄올, 200 mL)

데소니드

Desonide

흡 광 도   ---------------------------------- 15 ------- 1000 ---

디아세레인

Diacerein

확인시험  1) (생  략)

2) (생  략)

3) 이 약의 에탄올용액 (1 → 10000)을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 흡수스펙트럼을 측정할 때 파장 255 nm 및 340 nm부근에서 흡수극대를 나타낸다.

4) (생  략)

디아세레인

Diacerein

확인시험  1) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3) --------------------- 100000-------------------------------------------------------- 파장 217 nm, 255 nm ------------------------.

4) (현행과 같음)

레바미피드

Rebamipide

정 량 법  이 약을 건조하여 그 약 0.6 g을 정밀하게 달아 디메틸포름아미드 60 mL에 넣어 녹인 다음 0.1 mol/L 수산화칼륨액으로 적정한다. (지시약 : 페놀레드시액 2 방울) 다만, 종말점은 미황색이 무색으로 변할 때로 한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

레바미피드

Rebamipide

정 량 법  ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------액의 엷은 노란색이 엷은 보라색---------------------------------.

로얄젤리·히드로코르티손 크림

Royal Jelly and Hydrocortisone Cream

정 량 법  1) 로얄젤리 중 10-히드록시-2-데세노인산  이 약의 10-히드록시-2-데세노인산 (C10H18O3) 약 10 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 50 mL로 한 다음 흔들어 추출한다. 이 액을 여과한 다음 여액 10 mL를 취하여 염산을 넣어 산성으로 하여 에테르 30 mL씩으로 5회 추출한 다음 에테르층을 취하여 감압 증발 건조한다. 잔류물에 내부표준액 2 mL를 넣고 다시 감압 증발건고한 다음 잔류물에 TMS 화제 0.5 mL를 넣어 흔들어 섞은 것을 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 20 mg을 정밀하게 달아 에테르를 넣어 100 mL로 한 다음 이 액 10 mL를 취하여 내부표준액 2 mL를 넣고 감압 증발 건조시킨 다음 잔류물에 TMS 화제 0.5 mL를 넣고 흔들어 섞은 것을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 2 μL씩을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 내부표준물질의 피크면적에 대한  10-히드록시-2-데세노인산의 피크면적비 QT 및 Qs를 구한다.

10-히드록시-2-데세노인산 (C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg)

× [eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}] × [eqn: {1} over {2}]

조작조건

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 약 3 mm, 길이 약 2 m인 관에 기체크로마토그래프용디메틸폴리실록산을 177 ∼ 250 μm의 기체크로마토그래프용규조토에 입힌 것을 충전한다.

칼럼온도 : 190 ℃

주입구온도 : 250 ℃

검출기온도 : 190 ℃

운반기체 : 질소

유  량 : 40 mL/분

◦ 내부표준액 : 팔미틴산 약 50 mg을 달아 클로로포름에 녹여 100 mL로 한다.

◦ TMS화제 : BSA [N,O-Bis (trimethyl-sily) acetamide]와 TMCS ( trimethyl chlorosilane)의 2 :1 혼합액 (용시조제).

2) 히드로코르티손   (생  략)

로얄젤리·히드로코르티손 크림

Royal Jelly and Hydrocortisone Cream

정 량 법  1) 로얄젤리 중 10-히드록시-2-데세노인산  이 약의 10-히드록시-2-데세노인산으로서 약 5 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 메탄올 40 mL를 넣어 20 분간 초음파 처리하고, 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL 로 한다. 이 액을 원심분리 하여 위의 맑은 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 5 mg 을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 정확하게 50 mL로 한다. 이 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

10-히드록시-2-데세노인산(C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 214 nm)

이동상 : 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)·메탄올혼합액 (1：1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 :　표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 10-히드록시-2-데세노인산의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)  인산이수소칼륨 0.170 g을 물 980 mL에 녹이고 인산을 넣어 pH 3.0으로 조정한 다음 물을 넣어 1000 mL로 한다.

2) 히드로코르티손  (현행과 같음)

메틸페니데이트염산염

Methylphenidate Hydrochloride

순도시험 1) 에리트로[(R*, S*)]이성질체  이 약 및 메틸페니데이트염산염에리트로이성질체표준품을 메탄올에 녹여 각각 1 mL 중 50 mg 및 0.5 mg을 함유하는 용액을 만들어 검액 및 표준액으로 한다. (이하 생략)

정 량 법	(본문 생략)

조작조건

이동상 : 메탄올·2.7 g/L 인산이수소칼륨아세트산암모늄 수용액(1 : 2)에 인산을 넣어 pH를 4.6 ± 0.1로 조정한다.

시스템적합성

시스템의 성능 : 에리트로이성질체표준품 5 mg 및 메틸페니데이트염산염표준  품 0.5 g을 정밀하게 달아 이동상 1000 mL에 녹인다. (이하 생략)

메틸페니데이트염산염

Methylphenidate Hydrochloride

순도시험 1) 에리트로[(R*, S*)]이성질체 ----- 메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품----------------------------------------------------. (현행과 같음)

정 량 법	(현행과 같음)

조작조건

이동상 : ---0.02 mol/L 인산이수소칼륨시액-----------------------------------------------------.

시스템적합성

시스템의 성능 : 메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품--------------------- (현행과 같음)

l-무스콘

l-Muscone

정 량 법  이 약 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10.0 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100.0 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 l-무스콘표준품 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10.0 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100.0 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 3 μL씩을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하고 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 l-무스콘의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

l-무스콘(C16H30O)의 양(mg)

= l-무스콘표준품의 양(mg) [eqn: TIMES {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦  내부표준액 : 시클로펜타데카논의 클로로포름용액(1 → 500)

조작조건

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 약 3 mm, 길이 약 4 m의 유리관에 기체크로마토그래프용메틸실리콘폴리머를 150 ∼ 180 μm의 기체크로마토그래프용 규조토에 3 %의 비율로 피복한 것을 충전한다.

칼럼온도 : 180 ℃ 부근의 일정온도

이동가스 : 질소

유  량 : l-무스콘의 유지시간이 약 18 ∼ 20 분이 되도록 조정한다.

l-무스콘

l-Muscone

정 량 법  이 약 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 l-무스콘표준품 약 20 mg을 정밀하게 달아 내부표준액 10 mL를 넣고 클로로포름을 넣어 녹여 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 3 μL씩을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 l-무스콘의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

l-무스콘(C16H30O)의 양 (mg)

= l-무스콘표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦ 내부표준액 : 시클로펜타데카논의 클로로포름용액(1 → 500)

조작조건

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 약 0.32 mm, 길이 약 30 m인 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용디메틸폴리실록산을 0.25 μm의 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 180 ℃ 부근의 일정온도

검체도입부 온도 : 250 ℃

검출기 온도 : 260 ℃

운반기체 : 질소

유  량 : 1.0 mL/분

분할비 : 10 : 1

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 3 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질, l-무스콘 순서로 유출하고 분리도는 1.5 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 3 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 내부표준물질에 대한 l-무스콘의 피크면적비의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

미분화에토돌락 정

Etodolac Micronized Tablets

제제균일성시험  이 약 1 정을 달아 인산염완충액 (pH 7.5) 150 mL를 넣고 30 분간 초음파 처리하고 완충액을 넣어 200.0 mL로 한다. 이 액을 원심분리하고 위의 맑은 액 5.0 mL를 취하여 인산염완충액 (pH 7.5)을 넣어 200.0 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 에토돌락표준품 약 0.1 ｇ을 정밀하게 달아 인산염완충액 (pH 7.5)에 녹여 1 mL 중 25 μg을 함유한다하는 용액을 만들어 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 인산염완충액 (pH 7.5)을 대조로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 278 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

에토돌락 (C17H21NO3)의 양 (mg/정)

= [eqn: {rm T it ~ TIMES ~ rm it C it} over {D} TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

T : 미분화에토돌락정의 표시량 (mg/정)

C : 표준액의 농도 (μg/mL)

D : 검액의 농도 (μg/mL)

미분화에토돌락 정

Etodolac Micronized Tablets

제제균일성시험 시험할 때 적합하다.

미분화에토돌락 캡슐

Etodolac Micronized Capsules

제제균일성시험  다음과 같은 방법으로 함량균일성시험을 할 때 적합하다. 이 약 1 캡슐의 내용물을 200 mL 용량플라스크에 넣고 빈 캡슐을 인산염완충액 (pH 7.5)으로 씻어 넣는다. 완충액 150 mL를 넣고 30 분간 초음파 처리하고 완충액을 넣어 200.0 mL로 한다. 이 액을 원심분리하고 위의 맑은 액 5.0 mL를 취하여 완충액을 넣어 200.0 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 에토돌락표준품 약 0.1 g을 정밀하게 달아 인산염완충액 (pH 7.5)에 녹여 1.0 mL 중 25 μg을 함유한다하는 용액을 만들어 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 인산염완충액 (pH 7.5)을 대조로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 278 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

에토돌락 (C17H21NO3)의 양 (mg/캡슐)

= [eqn: {rm T it ` TIMES ` rm it C it} over {D} TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

T : 미분화에토돌락정의 표시량 (mg/캡슐)

C : 표준액의 농도 (μg/mL)

D : 검액의 농도 (μg/mL)

미분화에토돌락 캡슐

Etodolac Micronized Capsules

제제균일성시험  시험할 때 적합하다.

바캄피실린염산염 과립

Bacampicillin Hydrochloride Granules

정 량 법  원통평판법  (1) 배지  종층용 및 기층용한천배지 항생물질의 미생물학적 역가시험법 가)(2)(가)②㉮의 배지를 쓴다.

(2) 시험용균 Micrococcus luteus ATCC 9341을 시험용균으로 한다.

(3) 이 약의 표시역가에 따라 약 0.1 g (역가)을 정밀하게 달아 멸균정제수로 정확하게 250 mL로 한다. 이 액 적당량을 정확하게 취하여 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 8.0)으로 1 mL 중 4.0 mg (역가)이 함유되도록 희석시킨다. 이 액 10.0 mL를 정확하게 취하여 10 단위에 해당하는 에스테라제현탁액(돼지 간에서 추출한 카르복실에스테라제로서 3.2 mol/L 황산암모늄(pH 6.0)에 현탁시킨 액)을 넣은 다음 37 ℃ 수욕에서 때때로 흔들면서 1 시간 동안 반응시킨다. 이 액 적당량을 정확하게 취하여 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 8.0)으로 1 mL 중 0.20 및 0.05 μg (역가)이 함유되도록 희석시켜 고농도검액 및 저농도검액으로 한다. 따로 암피실린표준품 적당량을 정밀하게 달아 충분한 양의 멸균정제수를 넣어 녹여 1 mL 중 100 μg (역가)을 함유하는 표준원액을 만든다. 이 표준원액은 24 시간 이내에 쓴다. 정량할 때 이 표준원액 적당량을 정확하게 취하여 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 8.0)으로 1 mL 중 0.20 및 0.05 μg (역가)이 함유되도록 희석시켜 고농도표준액 및 저농도표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 항생물질의 미생물학적 역가시험법 가)(8)에 따라 시험한다.

바캄피실린염산염 과립

Bacampicillin Hydrochloride Granules

정 량 법  이 약을 가루로 하여 표시역가에 따라 약 40 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 바캄피실린염산염표준품 약 40 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 바캄피실린의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

암피실린(C16H19N3O4S)의 역가 (μg)

= 바캄피실린염산염표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정 온도

검체도입부 온도 : 4 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소나트륨용액 500 mL에 0.02 mol/L 인산수소나트륨용액을 넣어 pH를 6.8로 조정한다. 이 액 500 mL에 아세토니트릴 500 mL를 넣는다.

유  량 : 1 mL/분

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 20 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 바캄피실린 피크의 이론단수는 3000 단 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 바캄피실린의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

벤포티아민

Benfotiamine

확인시험 1) (본문 생략)

<신  설>

순도시험 1) ～ 5) (생  략)

6) 티아민  (전단 생략) 이 액 1 mL에 티아민정량용 브롬화시아노시액 3 mL를 넣어 흔들어 섞고 수산화나트륨용액(3 → 10) 1 mL와 1-부탄올 10 mL를 넣어 세게 흔들어 섞어 가만히 방치한 다음 1-부탄올층을 여과하여 얻은 액은 자외선 (주파장 379 nm)을 쪼일 때 나타나는 형광은 1 mL 중에 티아민염산염 5 mg을 함유한 수용액을 가지고 같은 방법으로 조작한 액의 형광보다 강하지 않다 (티아민염산염 0.1 % 이하).

벤포티아민

Benfotiamine

확인시험 1) (현행과 같음)

◦ 시스테인염산염 시액 : L-시스테인염산염 0.7 g에 아세트산ㆍ아세트산나트륨완충액 (pH 5.0) 10 mL을 넣어 녹이고, pH 5.0으로 조정하고 아세트산ㆍ아세트산나트륨완충액 (pH 5.0)을 넣어 20  mL로 한다.

◦ 효소 시액 : 아스페르길루스에서 얻은 전분당화력 및 인산에스테르 분해력이 강한 효소제 1 g에 아세트산․아세트산나트륨완충액(pH 5.0)을 넣어 100 mL로 한다. 쓸 때 조제한다.

순도시험 1) ～ 5) (현행과 같음)

6) 티아민  (현행과 같음) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 5 μg------------------------------------------------------------------------------------.

복방니코틴산아미드·로얄젤리·리보플라빈 캡슐

Compound Nicotinamide, Royal Jelly and Riboflavin Capsules

정 량 법  1) 10-히드록시-2-데세노인산  이 약 20 캡슐 이상을 가지고  그 질량을 정밀하게 단다. 10-히드록시-2-데세노인산 (C10H18O3) 약 20 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 100 mL로 한 다음 흔들어 추출한다. 이 액을 여과한 다음 여액 10 mL를 취하여 염산을 넣어 산성으로 하고 에테르 30 mL씩으로 5회 추출한 다음 에테르층을 취하여 감압 증발 건조한다. 잔류물에 내부표준액 2 mL를 넣고 다시 감압 증발건고한 다음 잔류물에 TMS 화제 0.5 mL를 넣어 흔들어 섞은 것을 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 20 mg을 정밀하게 달아 에테르를 넣어 100 mL로 한 다음 이 액 10 mL를 취하여 내부표준액 2 mL를 넣고 감압 증발 건조시킨 다음 잔류물에 TMS 화제 0.5 mL를 넣고 흔들어 섞은 것을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 2 μL씩을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 내부표준물질의 피크면적에 대한  10-히드록시-2-데세노인산의 피크면적비 QT 및 Qs를 구한다.

10-히드록시-2-데세노인산 (C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg)

× [eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

내부표준액 : 팔미틴산 약 50 mg을 달아 클로로포름에 녹여 100 mL로 한다.

조작조건

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 약 3 mm, 길이 약 2 m인 관에 기체크로마토그래프용디메틸폴리실록산을 177 ∼ 250 μm의 기체크로마토그래프용규조토에 입힌 것을 충전한다.

칼럼온도 : 190 ℃

주입구온도 : 250 ℃

검출기온도 : 190 ℃

운반기체 : 질소

유  량 : 40 mL/분

◦ TMS화제 : BSA [N,O-Bis (trimethyl-sily) acetamide]와 TMCS ( trimethyl chlorosilane)의 2 :1 혼합액 (용시조제).

(이하 생략)

복방니코틴산아미드·로얄젤리·리보플라빈 캡슐

Compound Nicotinamide, Royal Jelly and Riboflavin Capsules

정 량 법  1) 10-히드록시-2-데세노인산  이 약 20 캡슐 이상을 가지고 그 내용물의 질량을 정밀하게 단다. 10-히드록시-2-데세노인산으로서 약 5 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 메탄올 40 mL를 넣어 20 분간 초음파 처리하고 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로 한다. 이 액을 원심분리하여 위의 맑은 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 10-히드록시-2-데세노인산표준품 약 5 mg 을 정밀하게 달아 메탄올에 녹여 정확하게 50 mL로 한다. 이 액 2 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 10 mL로 한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

10-히드록시-2-데세노인산(C10H18O3)의 양 (mg)

= 10-히드록시-2-데세노인산표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 214 nm)

이동상 : 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)·메탄올혼합액 (1：1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 :　 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 10-히드록시-2-데세노인산의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 2.5 mmol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 3.0)  인산이수소칼륨 0.340 g을 물에 녹여 1000 mL로 하고 인산을 넣어 pH 3.0으로 조정한다.

(현행과 같음)

복방아스코르브산·리소짐염산염·
카르바조크롬 캡슐

Compound Ascorbic Acid,
Lysozyme Hydrochloride and
Carbazochrome Capsules

정 량 법  1) 아스코르브산, 리소짐염산염, 카르바조크롬  이 약 20 캡슐 이상을 가지고 그 내용물의 질량을 정밀하게 단다. 아스코르브산 (C6H8O6) 약 75 mg, 리소짐염산염 약 15 mg, 카르바조크롬 (C10H12N4O3) 약 1 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 정확하게 0.1 % 트리플루오로아세트산용액을 넣어 200 mL로 하여 30 분간 초음파 처리를 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 검액으로 한다. 따로 아스코르브산표준품 약 75 mg, 리소짐염산염표준품 약 15 mg, 카르바조크롬표준품 약 1 mg을 정밀하게 달아 정확하게 0.1 % 트리플루오로아세트산용액을 넣어 100 mL로 하여 30 분간 초음파 처리를 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 표준액으로 한다. (이하 생략)

복방아스코르브산·리소짐염산염·
카르바조크롬 캡슐

Compound Ascorbic Acid,
Lysozyme Hydrochloride and
Carbazochrome Capsules

정 량 법   1) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------  200 ---------------------------------------------------------------------------------. (현행과 같음)

브롬헥신염산염 정

Bromhexine Hydrochloride Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 질량을 정밀하게 달아 가루로 하여 브롬헥신염산염(C14H20Br2N2·HCl) 약 8 mg 해당하는 양을 정밀하게 단다. 80 % 메탄올 40 mL를 넣고 20 분간 흔들어 섞은 다음 80 % 메탄올을 넣어 50 mL로 하고 멤브레인필터(0.45 μm)에 여과하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 8 mg을 정밀하게 달아 이하 검액과 같이 조작하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 브롬헥신염산염의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl )의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 25 cm인 스테인레스강관에 5 μm 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 80 % 아세토니트릴

유  량 : 1.0 mL/분

브롬헥신염산염 정

Bromhexine Hydrochloride Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 질량을 정밀하게 달아 가루로 하여 브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl) 약 8 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 80 % 메탄올 40 mL를 넣고 20 분간 세게 흔들어 섞은 다음 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 32 mg을 정밀하게 달아 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 25 mL를 정확하게 취하여 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 브롬헥신염산염의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl )의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × [eqn: {1} over {4}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소칼륨액 (pH 3.5)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 브롬헥신염산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

브롬헥신염산염 주사액

Bromhexine Hydrochloride Injection

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 브롬헥신염산염(C14H20N2Br2·HCl) 6 mg에 해당하는 양을 정확하게 취한다. 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산시액을 넣어 100 mL로 한다. 이 액 25.0 mL를 50 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산을 넣어 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 30 mg을 정밀하게 달아 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산을 넣어 녹이고 100 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산으로 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 0.01 mol/L 염산을 대조로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 310 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl : 412.59)의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

브롬헥신염산염 주사액

Bromhexine Hydrochloride Injection

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 브롬헥신염산염(C14H20N2Br2·HCl) 8 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 80 % 메탄올 40 mL를 넣고 20 분간 세게 흔들어 섞은 다음 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하고 공경 0.45 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 검액으로 한다. 따로 브롬헥신염산염표준품 약 32 mg을 정밀하게 달아 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 25 mL를 정확하게 취하여 80 % 메탄올을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 브롬헥신염산염의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

브롬헥신염산염 (C14H20Br2N2·HCl)의 양 (mg)

= 브롬헥신염산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × [eqn: {1} over {4}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : 0.02 mol/L 인산이수소칼륨액 (pH 3.5)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 브롬헥신염산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

살리실산글리콜

Glycol Salicylate

순도시험  1) 산  (생  략)

2) 중금속  (생  략)

3) 유연물질  이 약 1.0 g을 클로로포름 100 mL에 녹여 검액으로 한다. 이 액 1.0 mL를 취하여 클로로포름으로 50.0 mL로 하여 표준액으로 한다. 이들 액을 갖고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 5 μL씩을 박층크로마토그래프용실리카겔을 써서 만든 박층판에 점적한다. 다음에 아세트산에틸·클로로포름·아세트산(100)혼합액(100 : 100 : 1)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 다음 박층판을 바람에 말린다. 이것을 요오드증기를 가득 채운 용기에 2 시간 방치할 때 검액에서 얻은 주반점 이외의 반점은 표준액에서 얻은 반점보다 진하지 않다.

살리실산글리콜

Glycol Salicylate

순도시험  1) 산  (현행과 같음)

2) 중금속  (현행과 같음)

3) 유연물질  ---- 0.1 g을 에탄올 ----------------------------- 1 ------------- 에탄올로 50 ----------------------------------- 가지고 --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 에틸아세테이트·n-헥산(27 : 20)------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

주사용 세프미녹스나트륨

Cefminox Sodium for Injection

정 량 법  이 약의 표시역가에 따라 약 0.5 g (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 1 mL 중 약 0.5 mg (역가)이 함유되도록 하여 검액원액으로 한다. 이 검액원액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액Ⅰ로 한다. 따로 검액원액 5 mL를 정확하게 취하여 히드록시암모늄염산염·아세트산염시액 5 mL를 넣어 30 분간 방치한 다음 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액Ⅱ로 한다. 따로 세프미녹스나트륨표준품 약 50 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준액원액으로 한다. 표준액원액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액Ⅰ로 한다. 따로 표준액원액 5 mL를 정확하게 취하여 염산히드록시암모늄염산염·아세트산염시액 5 mL를 넣어 30 분간 방치한 다음 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액Ⅱ로 한다. 검액Ⅰ, 검액Ⅱ, 표준액Ⅰ 및 표준액Ⅱ을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 273 nm에서의 흡광도 ATⅠ, ATⅡ, ASⅠ 및 ASⅡ를 측정한다.

세프미녹스(C16H21N7O7S3)의 역가 (μg)

[eqn: =~세프미녹스나트륨표준품의~역가~( mu g)`# # ``````````````````````````` TIMES ` {A _{rm TⅠ it} `-~A _{rm TⅡ it}} over {A _{rm SⅠ it} `-~A _{rm SⅡ it}} ` TIMES `10]

주사용 세프미녹스나트륨

Cefminox Sodium for Injection

정 량 법   이 약의 표시역가에 따라 세프미녹스나트륨 약 70 mg (역가)에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 세프미녹스나트륨표준품 약 70 mg (역가)을 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 세프미녹스의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

세프미녹스 (C16H21N7O7S3)의 역가 (μg)

= 세프미녹스나트륨표준품의 역가 (μg)

[eqn: TIMES it {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 273 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 완충액·메탄올혼합액 (9 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 세프미녹스의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 완충액  아세트산나트륨삼수화물 2.04 g을 달아 물 750 mL를 넣어 녹이고 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 물을 넣어 정확하게 1000 mL로 한다.

세프미녹스나트륨수화물

Cefminox Sodium Hydrate

정 량 법  자외가시부흡광도측정법  이 약 약 70 mg (역가)를 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 검액원액으로 한다. 검액원액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액Ⅰ로 한다. 따로 검액원액 5 mL를 정확하게 취하여 염산히드록실아민·아세트산염시액 5.0 mL를 넣어 30 분간 방치한 다음 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액Ⅱ로 한다. 따로 세프미녹스나트륨표준품 약 70 mg (역가)를 정밀하게 달아 물을 넣어 녹여 정확하게 100 mL로 하여 표준원액으로 한다. 표준원액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액Ⅰ로 한다. 따로 표준원액 5 mL를 정확하게 취하여 염산히드록실아민·아세트산염시액 5 mL를 넣어 30 분간 방치한 다음 0.1 mol/L 아세트산염완충액(pH 4.0)을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액Ⅱ로 한다. 검액Ⅰ, 검액Ⅱ, 표준액Ⅰ 및 표준액Ⅱ를 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 파장 273 nm에서 각각의 흡광도 ATⅠ, ATⅡ, ASⅠ 및 ASⅡ를 측정한다.

[eqn: 이~약~1mg중의~세프미녹스의~역가( mu g)# =~ {A _{rm TⅠ it} `-~A _{rm TII it}} over {A _{rm SⅠ it} `-~A _{rm SII it}} ` TIMES {세프미녹스나트륨표준품~채취량~중의`역가( mu g)} over {이~약의~채취량(mg)}]

세프미녹스나트륨수화물

Cefminox Sodium Hydrate

정 량 법  이 약 및 세프미녹스나트륨표준품 약 70 mg (역가) 씩을 정밀하게 달아 각각 물을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액 및 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 세프미녹스의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

세프미녹스(C16H21N7O7S3)의 역가 (μg)

= 세프미녹스나트륨표준품의 역가 (μg)

[eqn: TIMES it {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 273 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm의 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 25 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 완충액·메탄올혼합액 (9 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 세프미녹스의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 완충액  아세트산나트륨삼수화물 2.04 g을 달아 물 750 mL를 넣어 녹이고 아세트산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 물을 넣어 정확하게 1000 mL로 한다.

세프프로질 정

Cefprozil Tablets

용출시험  이 약 1 정을 취하여 시험액으로 물 900 mL를 써서 용출시험법 제 1 법에 따라 매분 100 회전으로 시험한다. 용출시험 시작 45 분에 용출액을 일정량을 취하여 공경 0.5 μm 이하의 멤브레인필터로 여과하여 물로 1 mL 중 0.4 mg (역가)이 함유되도록 희석하여 검액으로 한다. (이하 생략)

세프프로질 정

Cefprozil Tablets

용출시험  ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 0.3 mg ------------------------------. (현행과 같음)

셀레늄함유건조효모

Selenium in Dried Yeast

질    소  8.0 % 이상 (1 g) (질소정량법)

셀레늄함유건조효모

Selenium in Dried Yeast

질    소  8.0 % 이상 (30 mg) (질소정량법)

시네파지드말레산염 정

Cinepazide Maleate Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 표시량에 따라 시네파지드말레산염(C22H31N3O5·C4H4O4) 약 85 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 마개달린 250 mL 삼각플라스크에 넣고 물 25 mL, 클로로포름 75 mL, 아세트산염 완충액 (pH 2.8) 5 mL 및 지시약 5 mL를 넣고 잘 섞은 다음 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액으로 적정한다. 처음에 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액 5 mL를 넣고 아주 천천히 적정을 계속한다. 지시약의 색깔이 초록색에서 회분홍색으로 변할 때까지 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액을 넣을 때마다 세게 교반하고, 30 초 동안 방치하면서 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액 1 mL

= 5.336 mg C22H31N3O5·C4H4O4

◦  0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액 : 무수도큐세이트나트륨 4.446 g을 달아 1,000 mL 용량플라스크에 넣고, 물을 넣어 1000 mL로 한 다음 다음과 같이 표정한다. 건조 시네파지드말레산염표준품 약 0.35 g을 정밀하게 달아 100 mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 녹여 1000.0 mL로 한 다음 시네파지드말레산염 표준액으로 한다 (용시조제). 마개달린 250 mL 삼각플라스크에 표준액 10.0 mL를 정확하게 취하여 넣고, 물 15 mL, 클로로포름 75 mL, 아세트산염 완충액 (pH 2.8) 5 mL 및 p-디메틸아미노아조벤젠 15 mg을 클로로포름 20 mL에 녹인 용액과 오라세트비블루 15 mg을 아세트산(100) 3 mL에 녹인 용액을 잘 섞고 클로로포름을 넣어 500 mL로 한 (용시용제) 지시약 5 mL를 넣어 잘 섞은 다음 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액으로 적정한다. 처음에 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액 5 mL를 넣고 아주 천천히 적정을 계속한다. 지시약의 색깔이 초록색에서 회분홍색으로 변할 때까지 0.01 mol/L 도큐세이트나트륨액을 넣을 때마다 세게 교반하고 30 초 동안 방치하면서 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

시네파지드말레산염 정

Cinepazide Maleate Tablets

정 량 법   이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 시네파지드말레산염 (C22H31N3O5·C4H4O4) 약 50 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 0.05 mol/L 염산을 넣어 녹이고 초음파 처리한 다음 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 4 mL 및 내부표준액 10 mL를 정확하게 취하여 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 시네파지드말레산염표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 4 mL 및 내부표준액 10 mL를 정확하게 취하여 0.05 mol/L 염산을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 시네파지드말레산염의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

시네파지드말레산염 (C22H31N3O5·C4H4O4)의 양 (mg)

= 시네파지드말레산염표준품의 양 (mg) × [eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

◦ 내부표준액 : 벤조산나트륨의 수용액(1 → 10000)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 220 nm)

칼 럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃

이동상 : pH 2.4 인산염완충액·아세토니트릴혼합액 (4 : 1)

유 량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 시네파지드말레산염의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ pH 2.4 인산염완충액  인산이수소나트륨이수화물 3.1 g을 물 900 mL에 녹이고 인산을 넣어 pH를 2.4로 조정하고 물을 넣어 1000 mL로 한다.

시티딘

Cytidine

확인시험  1) (생  략)

2) (생  략)

3) 이 약의 0.001 % 0.1 mol/L 염산용액을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 흡수스펙트럼을 측정할 때 파장 280nm에서 흡수극대를 나타낸다. 또 파장 250 nm, 260 nm, 280 nm 및 290 nm에서 흡광도 비율은 다음과 같다.

E250/E260 = 0.45 ± 0.04

E280/E260 = 2.10 ± 0.07

E290/E260 = 1.60 ± 0.05

4) (생  략)

시티딘

Cytidine

확인시험  1) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 및 280 nm------------------------------------

E250/E260 = 0.45 ± 0.04

E280/E260 = 2.10 ± 0.07

<삭  제>

4) (현행과 같음)

아데노신트리포스페이트이나트륨삼수화물

Adenosine Disodium Triphosphate Trihydrate

확인시험  1) (생  략)

2) (생  략)

3) (생  략)

4) 이 약의 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 7.0)용액(1 → 80000)을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 흡수스펙트럼을 측정할 때 파장 260 nm 부근에서 흡수극대를 나타낸다.

순도시험  1) 용해상태  (생  략)

2) 중금속  (생  략)

3) 유연물질  (생  략)

4) 흡광도비  (생  략)

아데노신트리포스페이트이나트륨삼수화물

Adenosine Disodium Triphosphate Trihydrate

확인시험  1) (현행과 같음)

2) (현행과 같음)

3) (현행과 같음)

4) 이 약의 0.1 mol/L 인산염완충액(pH 7.0)용액(1 → 80000)을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 흡수스펙트럼을 측정할 때 파장 260 nm 부근에서 흡수극대를 나타낸다. 또 파장 250 nm, 260 nm 및 280 nm에서 흡광도 비율은 다음과 같다.

E250/E260 = 0.80 ± 0.2

E280/E260 = 0.15 ± 0.2

순도시험  1) 용해상태  (현행과 같음)

2) 중금속  (현행과 같음)

3) 유연물질  (현행과 같음)

<삭  제>

아목시실린수화물

Amoxicillin Hydrate

순도시험 4) 디메틸아닐린 (생  략)

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 1 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 디메틸아닐린에 대한 나프탈렌의 상대유지시간은 약 1.3 이고 디메틸아닐린의 신호대 잡음비는 10 보다 크지 않다.

아목시실린수화물

Amoxicillin Hydrate

순도시험 4) 디메틸아닐린 (현행과 같음)

시스템적합성

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 이상이다.

주사용 아스피린리신

Aspirin DL-Lysine for Injection

정 량 법  이 약 20 개 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 단다. 아스피린리신 (C15H22O6N2) 약 0.2 g에 해당하는 양을 정밀하게 달아 pH 7.4 인산염완충액을 넣어 200 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 pH 7.4 인산염완충액을 넣어 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 아스피린리신표준품 약 20 mｇ을 정밀하게 달아 pH 7.4 인산염완충액을 넣어 20 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 pH 7.4 인산염완충액을 넣어 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 262 nm에서의 흡광도 AS 및 AT를 측정한다.

아스피린리신 (C15H22N2O6)의 양 (mg)

= 아스피린리신표줌품의 양 (mg)[eqn: rm TIMES ` {it A _{rm T it} rm} over {it A _{rm S it} rm} ` TIMES ~10]

주사용 아스피린리신

Aspirin DL-Lysine for Injection

정 량 법   이 약 20 개 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 단다. 아스피린리신 (C15H22O6N2) 약 0.2 g에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 1 mL 및 물을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 아스피린리신표준품 약 20 mｇ을 정밀하게 달아 물을 넣어 20 mL로 한다. 이 액 10 mL를 취하여 내부표준액 1 mL 및 물을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 아스피린리신의 피크면적비 QT 및 QS를 측정한다.

아스피린리신(C15H22N2O6)의 양 (mg)

= 아스피린리신표준품의 양 (mg) × [eqn: {Q _{rm T}} over {Q _{rm S}}]

◦ 내부표준액 : 파라옥시벤조산에틸의 메탄올용액 (1 → 1250)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 274 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 30 ℃ 부근의 일정온도

이동상 : 인산염완충액 (pH 3.0)·메탄올혼합액 (1 : 1)

유 량 : 약 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 아스피린리신의 피크면적의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

알릴이소프로필아세틸우레아

Allylisopropylacetylurea

순도시험 1) ～ 3) (생  략)

4) 중금속  이 약 2.0 g을 달아 제 2 법에 따라 조작하여 시험한다. 비교액에는 납표준액 2.0 mL를 넣는다 (20 ppm 이하).

알릴이소프로필아세틸우레아

Allylisopropylacetylurea

순도시험 1) ～ 3) (현행과 같음)

4) 중금속  ---------------------------------------------------------------------10 ppm ---.

알마게이트 정

Almagate Tablets

제산력시험  이 약의 표시량에 따라 알마게이트 (건조물) 약 0.2 g에 해당하는 양을 정밀하게 달아 제산력시험법에 따라 시험한다.

알마게이트 정

Almagate Tablets

제산력시험  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. -------------------------------------------------------------------------------------------. 알마게이트 (건조물로서) 1 g 해당량은 0.1 mol/L 염산 260 mL 이상을 소비한다.

알마게이트 현탁액

Almagate Suspension

제산력시험  이 약을 잘 흔들어 섞어 알마게이트 (건조물) 약 0.2 g에 해당하는 양을 정확하게 취하여 제산력 시험법에 따라 시험한다.

알마게이트 현탁액

Almagate Suspension

제산력시험  ---------------------------------------------------------------------------------------------------. 알마게이트 (건조물로서) 1 g 해당량은 0.1 mol/L 염산 260 mL 이상을 소비한다.

암브록솔염산염 시럽

Ambroxol Hydrochloride Syrup

정 량 법  이 약을 잘 흔들어 섞은 다음 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl : 414.56) 30 mg에 해당하는 양을 정확하게 취한다. 100 mL 분액깔때기에 넣고 2 mol/L 수산화나트륨시액 10 mL를 넣고 에테르 45 mL로 2 회 추출한다. 에테르층을 모아 250 mL 분액깔때기에 넣고 물 10 mL로 2 회 씻는다. 여과지 위에 무수황산나트륨을 놓고 에테르층을 여과하여 여액을 증발건고 시킨다. 잔류물에 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 100 mL로 하여 여과한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 0.15 g을 정밀하게 달아 50 mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 50 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 100 mL 분액깔때기에 넣고 이하 검액과 같은 방법으로 조작하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 313 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl : 414.56)의 양 (mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {5}]

암브록솔염산염 시럽

Ambroxol Hydrochloride Syrup

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 15 mg을 정밀하게 달아 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 60 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES `2]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 244 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 탄산암모늄 1 g을 물 1000 mL에 녹이고 이 액 430 mL에 아세토니트릴 570 mL를 넣는다.

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 암브록솔의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

암브록솔염산염 정

Ambroxol Hydrochloride Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 하고 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl) 약 15 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 100 mL 용량플라스크에 넣고 메탄올 60 mL를 넣어 15 분간 추출한다. 메탄올을 넣어 100 mL로 하여 여과한다. 여액 50.0 mL를 100 mL 용량플라스크에 취하고 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 10 mL를 넣은 다음 메탄올을 넣어 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 75 mg을 정밀하게 달아 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 100 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 100 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 대조로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험할 때 파장 313 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다.

암브록솔염산염(C13H18Br2N2O·HCl)의 양(mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ~ {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ~ TIMES ~ {1} over {5}]

암브록솔염산염 정

Ambroxol Hydrochloride Tablets

정 량 법  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 암브록솔염산염(C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다.

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 시럽

Ambroxol Hydrochloride and Clenbuterol Hydrochloride Syrup

정 량 법  1) 암브록솔염산염  이 약의 표시량에 따라 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl) 10 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 250 mL 분액깔때기에 넣고 물 50 mL를 넣어 섞는다. 여기에 2 mol/L 수산화나트륨용액 10 mL를 넣어 알칼리성으로 한 다음 에테르 30 mL씩으로 5 회 진탕기로 잘 흔들어 섞어 에테르층을 모으고 물 30 mL로 씻는다. 여과지 위에 무수황산나트륨을 넣고 에테르층을 여과하여 여액을 증발건고 시킨다. 잔류물을 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 100 mL로 한다. 이 용액을 여과하고 여액 10 mL를 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 물을 넣어 50 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 분액깔때기에 넣고 이하 검액과 같은 방법으로 조작하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg)[eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {5}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용시아노실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 0.15 % 헵탄설폰산나트륨액·메탄올·이소프로판올혼합액 (80 : 18 : 2)을 아세트산(100)으로 pH 3.0으로 조정한다.

유  량 : 1.2 mL/분

2) 클렌부테롤염산염  이 약의 표시량에 따라 클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl) 0.1 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 500 mL 분액깔때기에 넣고 물 50 mL를 넣어 섞는다. 다음 2 mol/L 수산화나트륨용액 5 mL를 넣어 알칼리성으로 하고 에테르 40 mL씩으로 5 회 진탕기로 흔들어 섞어 에테르층을 모으고 물 30 mL로 세척한다. 세척된 에테르층을 1 mol/L 염산시액 10 mL씩으로 2 회 추출하여 물층을 25 mL 용량플라스크에 모으고 1 mol/L 염산시액을 넣어 25 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 25 mg을 정밀하게 달아 1 mol/L 염산시액을 넣어 250 mL로 한다. 이 액 1.0 mL를 취하여 25 mL 용량플라스크에 넣고 1 mol/L 염산시액을 넣어 25mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 각각 25 μL씩을 가지고 1)의 암브록솔염산염의 정량법의 조작조건으로 시험한다.

클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 클렌부테롤염산염표준품의 양 (mg)

[eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {250}]

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 시럽

Ambroxol Hydrochloride and Clenbuterol Hydrochloride Syrup

정 량 법  1) 암브록솔염산염  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다.

2) 클렌부테롤염산염  ｢클렌부테롤염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다.

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 정

Ambroxol Hydrochloride and Clenbuterol Hydrochloride Tablets

정 량 법	1) 암브록솔염산염  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl) 약 10 mg에 해당하는 양을 정밀하게 달아 250 mL 분액깔때기에 넣고 물 50 mL를 넣어 섞는다. 여기에 2 mol/L 수산화나트륨용액 10 mL를 넣어 알칼리성으로 한 다음 에테르 30 mL씩으로 5 회 진탕기로 잘 흔들어 섞어 에테르층을 모으고 물 30 mL로 씻는다. 여과지 위에 무수황산나트륨을 넣고 에테르층을 여과하여 여액을 증발건고 시킨다. 잔류물을 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 100 mL로 한다. 이 용액을 여과하고 여액 10 mL를 취하여 50 mL 용량플라스크에 넣고 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 50 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 암브록솔염산염표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 50 mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 50 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취하여 분액깔때기에 넣고 이하 검액과 같이 조작하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 암브록솔염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

암브록솔염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 암브록솔염산염표준품의 양 (mg)[eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {5}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용시아노실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 0.15 % 헵탄설폰산나트륨액·메탄올·이소프로판올혼합액 (80 : 18 : 2)을 아세트산(100)으로 pH 3.0으로 조정한다.

유  량 : 1.2 mL/분

2) 클렌부테롤염산염  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl) 약 0.1 mg 해당하는 양을 정밀하게 달아 500 mL 분액깔때기에 넣고 물 50 mL를 넣어 섞는다. 다음 2 mol/L 수산화나트륨시액 5 mL를 넣어 알칼리성으로 하고 에테르 40 mL씩으로 5 회 진탕기로 흔들어 섞어 에테르층을 모으고 물 30 mL로 세척한다. 세척된 에테르층을 1 mol/L 염산시액 10 mL씩으로 2 회 추출하여 물층을 25 mL 용량플라스크에 모으고 1 mol/L 염산시액을 넣어 25 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 25 mg을 정밀하게 달아 1 mol/L 염산시액을 넣어 250 mL로 한다. 이 액 1.0 mL를 취하여 25 mL 용량플라스크에 넣고 1 mol/L 염산시액을 넣어 25 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 25 μL씩을 가지고 1)의 암브록솔염산염의 정량법의 조작조건으로 시험한다.

클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 클렌부테롤염산염표준품의 양 (mg)[eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {250}]

암브록솔염산염·클렌부테롤염산염 정

Ambroxol Hydrochloride and Clenbuterol Hydrochloride Tablets

정 량 법	1) 암브록솔염산염  ｢암브록솔염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 암브록솔염산염(C13H18Br2N2O·HCl) 약 30 mg에 해당하는 양을 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액 120 mL를 넣어 초음파로 15 분간 추출한 다음 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 검액으로 한다.

2) 클렌부테롤염산염  ｢클렌부테롤염산염 시럽｣ 정량법에 따라 시험한다. 다만, 이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 클렌부테롤염산염 약 0.1 mg에 해당하는 양을 취하여 이동상을 60 mL를 넣어 15 분간 추출한 다음 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 10 mg을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액으로 한다.

암피실린나트륨

Ampicillin Sodium

순도시험 1) ～ 4) (생  략)

5) 디메틸아닐린 (생  략)

시스템 적합성

시스템의 성능 : 표준액 1 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 디메틸아닐린에 대한 나프탈렌의 상대유지시간은 약 1.3 이고 디메틸아닐린의 신호대 잡음비는 10 보다 크지 않다.

암피실린나트륨

Ampicillin Sodium

순도시험  1) ～ 4) (현행과 같음)

5) 디메틸아닐린 (현행과 같음)

시스템 적합성

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 이상이다.

옥틸로늄브롬화물

Octylonium Bromide

정 량 법  이 약을 건조하여 약 1 g을 정밀하게 달아 클로로포름 20 mL를 넣어 녹인 다음 아세트산탈수물 40 mL를 넣고 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다(적정종말점검출법의 전위차적정법). 필요하면 지시약으로 메틸로사닐린염화물시액 3 방울을 넣고 직접 적정한다. 다만, 적정의 종말점은 액의 적자색이 연한 노란색으로 변할 때로 한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL = 56.357 mg C29H43O4N2Br

옥틸로늄브롬화물

Octylonium Bromide

정 량 법  이 약을 건조하여 약 0.45 g을 정밀하게 달아 비커에 넣고 무수포름산 2 mL를 가하고 아세트산탈수물 50 mL에 녹인 후 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다(적정종말점검출법의 전위차적정법). 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL = 56.357 mg C29H43O4N2Br

카르바조크롬

Carbazochrome

순도시험  1) 염화물  (생  략)

2) 중금속  (생  략)

3) 철  이 약 0.5 g을 달아 강열하고 그 잔류물에 염산 2 mL를 넣고 수욕에서 가열하여 물 10 mL를 넣은 다음 과황산암모늄용액 (3 → 100) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞고 물을 넣어 20 mL로 하여 티오시안산암모늄시액 2 mL를 넣을 때 액의 색은 다음의 비교액보다 진하지 않다.

비교액 : 철표준액 3.0 mL에 염산 2 mL를 넣고 같은 방법으로 조작한다.

4) 비소  (생  략)

카르바조크롬

Carbazochrome

순도시험  1) 염화물  (현행과 같음)

2) 중금속  (현행과 같음)

3) 철  이 약 0.5 g을 달아 강열하고 그 잔류물에 철시험법 제 1 법에 따라 검액으로 한다. 따로 철표준액 3.0 mL를 취하여 같은 방법으로 조작하여 비교액으로 하고 철시험법 A 법에 따라 시험한다.

4) 비소  (현행과 같음)

카르보닐철

Carbonyliron

입도시험  이 약 10 g을 가지고 미국약전 표준망체를 통과시킬 때 200 호 체를 전량 통과하고 325호 체에 잔류하는 것은 전체량의 5 % 이하이다.

카르보닐철

Carbonyliron

입도시험  ----------------- 체를 --------------------------------------------- 330 호 ----------------------------------.

케토티펜푸마르산염 정

Ketotifen Fumarate Tablets

용출시험  이 약 1 정을 취하여 시험액으로 0.1 mol/L 염산 500 mL를 써서 제 1 법에 따라 매 분 120 회전으로 시험한다. 용출시험 시작 30 분 후에 용출액 20 mL를 가지고 여과하여 검액으로 한다. 따로 케토티펜푸마르산염표준품 약 14 mg을 정밀하게 달아 500 mL 용량플라스크에 넣고 0.1 mol/L 염산을 넣어 녹여 표선까지 채워 섞는다. 이 액 5.0 mL를 가지고 0.1 mol/L 염산을 대조액으로 하여 자외가시부흡광도측정법에 따라 시험하여 파장 300 nm에서의 흡광도 AT 및 AS를 측정한다. 이 약의 30 분 간의 용출률이 80 % 이상일 때 적합하다.

(생  략)

케토티펜푸마르산염 정

Ketotifen Fumarate Tablets

용출시험  --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 이 액 2 mL를 정확하게 취하여 0.1 mol/L 염산을 넣어 20 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 --------------------------------------------------------------------------------------.

(현행과 같음)

콜레칼시페롤·탄산칼슘 캡슐

Cholecalciferol and Calcium Carbonate Capsules

확인시험  1)  이 약을 가지고 비타민 시험법에 따라 시험한다.

2)  이 약의 내용물을 가지고 미국약전 탄산칼슘의 확인시험에 따라 시험한다.

정 량 법  1) 콜레칼시페롤  (생  략)

2) 탄산칼슘  이 약 20 캡슐 이상을 가지고 그 내용물의 질량을 정밀하게 달아 미국약전 탄산칼슘 정의 정량법에 따라 시험한다.

콜레칼시페롤·탄산칼슘 캡슐

Cholecalciferol and Calcium Carbonate Capsules

확인시험  1) 콜레칼시페롤  이 약을 가지고 비타민시험법에 따라 시험한다.

2) 탄산칼슘 중 칼슘  이 약의 내용물을 가지고 탄산칼슘 0.5 g에 해당하는 양을 묽은염산 10 mL에 녹이고 끓여 식힌 다음 암모니아시액을 넣어 중성으로 한 액은 칼슘염의 정성반응 3)을 나타낸다.

3) 탄산칼슘 중 탄산염  이 약은 탄산염의 정성반응 1)을 나타낸다.

정 량 법  1) 콜레칼시페롤  (현행과 같음)

2) 탄산칼슘   이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 탄산칼슘 (CaCO3) 200 mｇ에 해당하는 양을 달아 도가니에 넣고 800 ℃에서 강열하여 회화시킨 다음 식힌다. 이 잔류물을 물 10 mL 및 3 mol/L 염산 3 mL에 넣어 녹이고 물을 넣어 150 mL로 한다. 이 액에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣고 0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액으로 적자색에서 파란색이 될 때까지 적정한다(지시약 : 히드록시나프톨블루 300 mg). 물 150 mL에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣어 공시험액으로 하여 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액 1 mL = 5.004 mg CaCO3

콜린알포세레이트 캡슐

Choline Alphoscerate Tablets

붕해시험  (생  략)

<신  설>

콜린알포세레이트 캡슐

Choline Alphoscerate Tablets

<삭  제>

용출시험  이 약 1 캡슐을 취하여 시험액으로 물 900 mL를 써서 용출시험법 제 2 법에 따라 매 분 50 회전으로 시험한다. 용출시험 시작 45 분 후에 용출액을 여과하여 검액으로 한다. 따로 콜린알포세레이트표준품 약 111.1 mg을 정밀하게 달아 물에 녹여 정확하게 25 mL로 한다. 이 액을 여과한 다음 5 mL를 취하여 물에 녹여 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 50 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 콜린알포세레이트의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다. 이 약의 45 분간의 용출률이 85 % 이상일 때 적합하다.

콜린알포세레이트(C8H20NO6P)의 표시량에 대한 용출률 (%)

= [eqn: W _{rm S` it} ` TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} TIMES {1} over {C} ` TIMES `360]

WS : 콜린알포세레이트표준품의 양     (mg)

C : 1 정 중 콜린알포세레이트(C8H20NO6P)의 표시량 (mg)

조작조건

검출기 : 시차굴절계

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 25.0 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용아미노프로필실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 38 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 60 % 아세토니트릴

유  량 : 1.5 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 50 μL씩을 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 콜린알포세레이트의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

주사용 클래리트로마이신

Clarithromycin for Injection

정 량 법  이 약의 표시역가에 따라 클래리트로마이신 (C38H69NO13) 약 0.5 g (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 세게 흔들어 섞고 1 mL 중 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 5 mL를 정확하게 취하여 이동상으로 50 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 따로 클래리트로마이신표준품 약 50 mg (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 녹여 1 mL 당 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 5 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 검액 및 표준액 중의 클래리트로마이신의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

클래리트로마이신(C38H69NO13)의 역가 (μg)

= 클래리트로마이신표준품의 역가 (μg)[eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES `10]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 210 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 메탄올·0.067 mol/L 인산이수소칼륨용액 혼합액 (3 : 2)에 인산을 넣어 pH를 3.5로 조정한다.

유  량 : 1.0 mL/분

주사용 클래리트로마이신

Clarithromycin for Injection

정 량 법  이 약의 표시역가에 따라 클래리트로마이신 (C38H69NO13) 약 0.5 g (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 세게 흔들어 섞고 1 mL 중 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 2 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 2 mL를 넣은 후 이동상으로 정확하게 20 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 따로 클래리트로마이신표준품 약 50 mg (역가)을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 녹여 1 mL 당 5 mg (역가)을 함유하는 용액을 만든다. 이 용액 2 mL를 정확하게 취하여 내부표준액 2 mL를 넣은 후 이동상으로 정확하게 20 mL로 한 다음 여과하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 내부표준물질의 피크면적에 대한 클래리트로마이신의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

클래리트로마이신 (C38H69NO13)의 역가 (μg)

= 클래리트로마이신표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}} ` TIMES `10]

◦ 내부표준액  파라옥시벤조산프로필의 이동상용액 (1 → 20000)

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 210 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

칼럼온도 : 40 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : 메탄올·0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액(pH 2.0) 혼합액 (3 : 2)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질, 클래리트로마이신의 순서로 유출하고 분리도는 3.0 이상이다.

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 내부표준물질의 피크면적에 대한 클래리트로마이신의 피크면적비의 상대표준편차는 1.0 % 이하이다.

◦ 0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액 (pH 2.0)  0.05 mol/L 인산이수소칼륨시액에 인산을 넣어 pH 2.0으로 조정한다.

클래리트로마이신

Clarithromycin

정 량 법  (본문 생략)

조작조건

검출기 : (생  략)

칼  럼 : (생  략)

칼럼온도 : 50 ℃ 부근의 일정 온도

이동상 : (생  략)

유  량 : (생  략)

시스템적합성

시스템의 성능 : 표준액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질, 클래리트로마이신의 순서로 유출하고 분리도는 3.0 이상이다.

시스템의 재현성 : (생 략)

클래리트로마이신

Clarithromycin

정 량 법  (현행과 같음)

조작조건

검출기 : (현행과 같음)

칼  럼 : (현행과 같음)

칼럼온도 : 40 ---------------

이동상 : (현행과 같음)

유  량 : (현행과 같음)

시스템적합성

시스템의 성능 : ----------------------------------------------------------------------------------------- 1.5 ---------.

시스템의 재현성 : (현행과 같음)

클렌부테롤염산염 시럽

Clenbuterol Hydrochloride Syrup

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl) 0.1 mg에 해당하는 양을 정확하게 취한다. 물 50 mL를 넣어 섞고 2 mol/L 수산화나트륨시액 5 mL를 넣어 알칼리성이 되게 한 다음 에테르 40 mL씩 4 회 흔들어 추출하여 추출액을 물 30 mL로 씻은 다음 에테르층을 1 mol/L 염산시액 10 mL씩 2 회 추출하여 물층을 25 mL 용량플라스크에 넣고 내부표준액 2.0 mL를 넣고 1 mol/L 염산시액으로 표선을 맞추어 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 25 mg을 정밀하게 달아 1 mol/L 염산시액을 넣어 250 mL로 한다. 이 액 1.0 mL를 취하여 내부표준액 2.0 mL 및 1 mol/L 염산시액을 넣어 25 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 각 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하고 각 액의 내부표준물질에 대한 클렌부테롤염산염의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.

클렌부테롤염산염 (C12H18Cl2N2O·HCl)의 양 (mg)

= 클렌부테롤염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {250}]

◦ 내부표준액  카페인표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 물을 넣어 100 mL로 한다. 이 액 10.0 mL를 취해 물을 넣어 100 mL로 하여 내부표준액으로 한다.

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용시아노실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 물·메탄올·이소프로판올·0.15 % 헵탄설폰산나트륨액혼합액 (80 : 18 : 2 : 0.15) 을 비수적정용아세트산(100)으로 pH 3.0으로 조정한다.

유  량 : 1.5 mL/분

클렌부테롤염산염 시럽

Clenbuterol Hydrochloride Syrup

정 량 법  이 약의 표시량에 따라 클렌부테롤염산염 약 10 μg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 20 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 클렌부테롤염산염표준품 약 10 mg을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 이동상을 넣어 정확하게 200 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 클렌부테롤염산염의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

클렌부테롤염산염 (C13H18Br2N2O·HCl)의 양 (μg)

= 클렌부테롤염산염표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} ` TIMES ` {1} over {1000}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 215 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 옥탄설폰산나트륨 6 g 및 인산이수소칼륨 5 g을 물 1000 mL에 녹인 다음 인산으로 pH를 3.0으로 조정한 액·아세토니트릴·메탄올혼합액 (3 : 1 : 1)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 클렌부테롤의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

클로르페니라민말레산염 주사액

Chlorpheniramine Maleate Injection

정 량 법  (전단 생략) 에테르추출액을 합하여 물 20 mL로 씻고 다음에 0.25 mol/L 황산시액 20 mL, 20 mL 및 5 mL로 추출한다. 모든 추출액을 합하여 0.25 mol/L 황산시액을 넣어 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 20 mL를 정확하게 달아 100 mL의 분액깔대기에 넣어 수산화나트륨시액 2 mL를 넣은 다음 에테르 50 mL 씩으로 2 회 추출한다. 따로 클로르페니라민말레산염표준품을 105 ℃에서 3 시간 건조하여 약 30 mg을 정밀하게 달아 물에 녹여 정확하게 200 mL로 한다. 이 액 20 mL를 정확하게 취하여 100 mL의 분액깔때기에 넣고 수산화나트륨시액 2 mL를 넣은 다음 에테르 50 mL씩 2 회 추출한다. (이하 생략)

클로르페니라민말레산염 주사액

Chlorpheniramine Maleate Injection

정 량 법  (현행과 같음) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 정확하게 50 mL로 한다. 이 액 10 mL를 정확하게 취하여 0.25 mol/L 황산시액을 넣어 정확하게 25 mL로 하여 검액으로 한다. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------. (현행과 같음)

탄산칼슘·콜레칼시페롤 정

Calcium Carbonate and Cholecalciferol Tablets

확인시험  1) 탄산칼슘  이 약을 가지고 미국약전 탄산칼슘의 확인시험에 따라 시험한다.

2) 콜레칼시페롤  이 약을 가지고 비타민시험법에 따라 시험한다.

정 량 법  1) 탄산칼슘  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한 다음 미국약전 탄산칼슘 정의 정량법에 따라 시험한다.

2) 콜레칼시페롤  (생  략)

콜레칼시페롤·탄산칼슘 정

Cholecalciferol and Calcium Carbonate Tablets

확인시험  1) 콜레칼시페롤  이 약을 가지고 비타민시험법에 따라 시험한다.

2) 탄산칼슘 중 칼슘  이 약을 가지고 탄산칼슘 0.5 g에 해당하는 양을 묽은염산 10 mL에 녹이고 끓여 식힌 다음 암모니아시액을 넣어 중성으로 한 액은 칼슘염의 정성반응 3)을 나타낸다.

3) 탄산칼슘 중 탄산염  이 약은 탄산염의 정성반응 1)을 나타낸다.

정 량 법	1) 콜레칼시페롤  (현행과 같음)

2) 탄산칼슘  이 약 20 정 이상을 가지고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한다. 탄산칼슘 (CaCO3) 200 mｇ에 해당하는 양을 달아 도가니에 넣고 800 ℃에서 강열하여 회화시킨 다음 식힌다. 이 잔류물을 물 10 mL 및 3 mol/L 염산 3 mL에 넣어 녹이고 물을 넣어 150 mL로 한다. 이 액에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣고 0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액으로 적자색에서 파란색이 될 때까지 적정한다(지시약 : 히드록시나프톨블루 300 mg). 물 150 mL에 1 mol/L 수산화나트륨시액 15 mL를 넣어 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.05 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이나트륨액 1 mL = 5.004 mg CaCO3

티로트리신 겔

Tyrothricin Gel

정 량 법  비탁법 (1) 배지 (가) 시험균이식용한천배지

펩톤	5.0 g

포도당	100 g

효모엑스	20.0 g

인산이수소칼륨	2.0 g

한천	15.0 ∼ 20.0 g

폴리소르베이트80	0.1 g

이상을 달아 정제수를 넣어 1000 mL로 하고 멸균 후의 pH가 6.7 ∼ 6.8이 되도록 한다.

(나) 시험균부유용액체배지

펩톤	5.0 g

포도당	1.0 g

효모엑스	1.5 g

인산수소이칼륨	3.68 g

육엑스	1.5 g

인산이수소칼륨	1.32 g

염화나트륨	3.5 g

이상을 달아 정제수를 넣어 1000 mL로 하고 멸균 후의 pH가 6.95 ∼ 7.05가 되도록 한다.

(2) 시험용균 및 시험용균액 Enterococcus faecium ATCC 10541을 시험용균으로 한다. 시험용균을 고층을 만든 시험균이식용한천배지에 천자배양하고 37 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양하여 적어도 3 회 계대배양하고 5 ℃ 이하에서 저장한다. 이 균을 시험균부유용액체배지 8 ∼ 10 mL에 이식하고 37 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양하여 균액으로 한다. 쓸 때 이 균액 약 1.0 mL를 시험균부유용액체배지 100 mL에 넣어 시험균액으로 한다.

(3) 이 약 적당량을 정밀하게 달아 에탄올을 넣어 녹여 적당한 농도의 용액을 만든 다음 이 용액 적당량을 정확하게 취하여 에탄올로 1 mL 중 0.2 μg (역가)이 함유되도록 희석하여 검액으로 한다. 따로 그라미시딘표준품 적당량을 정밀하게 달아 에탄올을 넣어 녹여 1 mL 중 1 mg (역가)을 함유한다하는 표준액원액을 만든다. 이 표준액원액은 5 ℃ 이하에서 저장하며 30 일 이내에 쓴다. 정량할 때 이 표준액원액 적당량을 정확하게 취하여 에탄올로 1 mL 중 그라미시딘 0.028, 0.034, 0.040, 0.048 및 0.057 μg (역가)이 함유되도록 희석하여 표준액으로 한다. 각 군의 시험관에 각 농도의 표준액 및 검액 1.0 mL씩을 각각 취한다. 검액의 평균흡광도를 구하여 그라미시딘의 표준곡선에서 그라미시딘의 농도를 구하고 이 수치에 5 배를 곱하여 검체 중의 티로트리신의 양(μg)을 구한다.

티로트리신 겔

Tyrothricin Gel

정 량 법  --------------------------------------

----	----

-----	10.0 g

-------	----

-------------	----

----	----------

-------------	----

-------------------------------------------------------------------

-------------------

----	-----

-----	-----

------	-----

----------	------

-----	-----

----------	------

--------	-----

---------------------------------------------------------------------

(2) 시험용균 및 시험용균액 Enterococcus hirae ATCC 10541을 시험용균으로 한다. 시험용균을 시험균이식용한천배지에 접종하여 37 ± 0.5 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양한다. 시험균이식용한천배지 또는 시험균부유용액체배지를 이용하여 37 ± 0.5 ℃에서 적어도 3 회 계대배양하고 마지막 계대의 균은 시험균부유용액체배지 8 ∼ 10 mL에 이식하여 37 ± 0.5 ℃에서 20 ∼ 24 시간 배양하여 균액으로 한다. 쓸 때 이 균액 약 1.0 mL를 시험균부유용액체배지 100 mL에 넣어 시험균액으로 한다. 단, 시험균이식용한천배지 대신 균주특성에 맞는 영양한천배지를 사용할 수 있다.

(3) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 시험관 3 개를 1 군으로 한다. 표준액의 각 농도마다 각각 1 군으로 하고 또 검액도 1 군을 쓴다. 각 군의 시험관에 각 농도의 표준액 및 검액 100 μL씩을 각각 취하여 넣고 시험용 균액 10 mL 씩을 넣어 마개를 닫은 후 37 ℃에서 3 ∼ 4 시간 배양한다. 따로 에탄올 100 μL와 시험균 부유용 액체배지 10 mL를 넣은 시험관도 같이 배양하여 대조액으로 한다. 배양 후 포름알데히드용액(1 → 3) 0.5 mL 씩을 각 군의 시험관 및 대조액에 넣고 분광광도계를 써서 파장 530 nm에서 평균흡광도를 측정한다. ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

티오콜키코시드

Thiocolchicoside

흡 광 도  [eqn: rm E` _{1cm} ^{1%}] (260 nm) : 380 ∼ 400 (건조한 다음 1 g, 물, 100 mL)

[eqn: rm E` _{1cm} ^{1%}] (372 nm) : 322 ∼ 338 (건조한 다음 1 g, 물, 100 mL)

티오콜키코시드

Thiocolchicoside

흡 광 도  --------------------------------- 10 mg ---- 1000 ---

----------------------------------- 10 mg ---- 1000 ---

티옥트산

Thioctic Acid

순도시험 1) 염화물 (생  략)

2) 황산염 1) 의 액 50 mL를 가지고 시험한다. 비교액에는 0.05 mol/L 황산 0.4 mL를 넣는다 (0.192 % 이하).

티옥트산

Thioctic Acid

순도시험 1) 염화물 (현행과 같음)

2) 황산염 ------------------------------------- 0.005 ---------------------------------.

파록세틴염산염수화물

Paroxetine Hydrochloride Hydrate

순도시험 1) 중금속 (생  략)

2) 유연물질 I (전단 생략) 따로 파록세틴유연물질 Ⅰ {(3S,4R)-3-[(1,3-벤조디옥솔-5-일옥시)메틸]-4-(4-에톡시페닐)피페리딘((+)-트랜스-파록세틴)} 표준품 5 mg 및 파록세틴염산염수화물표준품 5 mg을 메탄올 2 mL에 녹이고 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 표준액 (2)로 한다. (이하 생략)

파록세틴염산염수화물

Paroxetine Hydrochloride Hydrate

순도시험 1) 중금속 (현행과 같음)

2) 유연물질 I (현행과 같음) -- 파록세틴유연물질 Ⅰ {(3S,4R)-3-[(1,3-벤조디옥솔-5-일옥시)메틸]-4-(4-플루오르페닐)피페리딘((+)-트랜스-파록세틴)} ------------------------------------------------------------------------------------------------------------. (현행과 같음)

퓨시드산나트륨 정

Fusidate Sodium Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 필요하면 당의를 벗기고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한 다음 이 약의 표시역가에 따라 약 0.5 g (역가)에 해당하는 양을 정밀하게 달아 물 25 mL를 넣어 세게 흔들어 섞고 유리여과기를 써서 여과하고 유리여과기는 물 15 mL로 씻는다. 여액과 세액을 합하고 클로로포름 10 mL를 넣고 저으면서 0.1 mol/L 염산으로 전위차 적정한다 (적정종말점검출법의 전위차적정법). 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 염산 1 mL = 51.67 mg C31H48O6

퓨시드산나트륨 정

Fusidate Sodium Tablets

정 량 법  이 약 20 정 이상을 가지고 필요하면 당의를 벗기고 그 질량을 정밀하게 달아 가루로 한 다음 이 약의 표시역가에 따라 약 250 mg (역가)에 해당하는 양을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 녹여 정확하게 250 mL로 하고 이 액 4 mL를 취해 이동상으로 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 퓨시드산표준품 약 20 mg (역가)을 정밀하게 달아 이동상을 넣어 정확하게 50 mL로 하고 이 액 5 mL를 정확하게 취해 이동상을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 10 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 퓨시드산의 피크면적 AT 및 AS를 측정한다.

퓨시드산(C31H48O6)의 역가 (μg)

= 퓨시드산표준품의 역가 (μg) [eqn: TIMES ` {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}}] × 12.5

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 235 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 15 cm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 아세토니트릴·0.05 mol/L 인산용액·메탄올혼합액 (5 : 4 : 1)

유  량 : 1.2 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 10 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 퓨시드산의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

프랄리독심염화물

Pralidoxime Chloride

정량법 (본문 생략)

프라제팜 (C19H17ClN2O)의 표시량에 대한 용출률 (%)

= [eqn: W _{rm S it} TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} TIMES {V`` prime } over {V} TIMES {90} over {C}]

프랄리독심염화물

Pralidoxime Chloride

정량법 (현행과 같음)

프랄리독심염화물(C7H9ClN2O)의 양 (mg)

= [eqn: C TIMES {A _{rm T it}} over {A _{rm S it}} TIMES 50]

C : 표준액의 농도 (mg/mL)

플루나리진염산염

Flunarizine Dihydrochloride

순도시험  1) 중금속  (생  략)

2) 유연물질  이 약 0.40 g을 달아 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)에 녹여 10.0 mL로 하여 검액으로 한다. 이 액 1.0 mL를 취하여 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)을 넣어 50.0 mL로 하고 이 액 5.0 mL를 취하여 메탄올·클로로포름혼합액(1 : 1)을 넣어 50.0 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 5 μL씩을 박층크로마토그래프용 실리카겔 (형광제 포함)을 써서 만든 박층판에 점적한 다음 테트라히드로푸란·물·메탄올·강암모니아수혼합액(40 : 30 : 30 : 1)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개한 다음 박층판을 바람에 말린다. 여기에 자외선(주파장 254 nm)을 쪼일 때 검액에서 얻은 주반점 이외의 반점은 표준액에서 얻은 반점보다 진하지 않다.

플루나리진염산염

Flunarizine Dihydrochloride

순도시험  1) 중금속  (현행과 같음)

2) 유연물질  --- 0.4 g을 달아 메탄올에 녹여 정확하게 10 mL로 ------------------------------- 1 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로 하고 이 액 5 mL를 정확하게 취하여 메탄올을 넣어 정확하게 50 mL로 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

플루오로메톨론·테트라히드로졸린염산염 점안현탁액

Fluorometholone and Tetrahydrozoline Hydrochloride Ophthalmic Suspension

확인시험 1) 플루오로메톨론  이 약을 세게 흔들어 섞은 다음 4 mL를 취하여 분액깔때기에 넣고 염화나트륨 1 g을 넣어 염화나트륨이 녹을 때까지 세게 흔들어 녹인다. 여기에 1 mol/L 염산 2 mL를 넣고 클로로포름 20 mL씩으로 5 회 추출하여 추출액을 250 mL 둥근 플라스크에 합하여 넣고 증발농축기에서 증발 건조시킨다. 잔류물에 4 mL의 메탄올을 넣어 녹여 검액으로 한다. 따로 플루오르메톨론표준품 20 mg을 달아 메탄올을 넣어 녹여 20 mL로 하여 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 25 μL 을 박층크로마토그래프용실리카겔 (형광제첨가)을 써서 만든 박층판에 점적한다. 다음에 톨루엔·메탄올·아세트산에틸혼합액 (80 : 20 : 20)을 전개용매로 하여 약 10 cm 전개시킨 다음 박층판을 바람에 말린다. 여기에 자외선 (주파장 254 nm)을 쪼이거나 발색제를 고르게 뿌린 다음 110 ℃에서 10 분 동안 가열할 때 검액 및 표준액에서 얻은 반점의 Rƒ 값 및 색상은 같다.

◦ 발색제 : 얼음물로 식히면서 메탄올 10 mL가 담겨져 있는 비커 속으로 조심스럽게 황산 10 mL를 넣는다. 이 시액은 기밀용기에서 1 주일 동안 보관할 수 있다.

2) 테트라히드로졸린염산염  이 약 10 mL를 취하여 여과지로 여과한 다음 여액 8.0 mL 취하여 분액깔때기에 넣고 2 mol/L 수산화나트륨액 2 mL와 염화나트륨 2 g을 넣어 염화나트륨이 녹을 때까지 세게 흔들어 녹인다. 이것을 클로로포름 10 mL씩으로 5 회 추출하여 추출액을 100 mL의 둥근플라스크에 합하여 넣고 증발농축기에 증발건조 시킨다. 잔류물에 에탄올 2 mL를 넣어 녹여 검액으로 한다. 따로 테트라히드로졸린염산염표준품 약 50 mg을 정밀하게 달아 에탄올을 넣어 녹여 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액 25 μL씩을 박층크로마토그래프용실리카겔 (형광제 첨가)을 써서 만든 박층판에 점적한다. 다음에 클로로포름·에테르·메탄올·17% 암모니아수혼합액 (60 : 60 : 16 : 5)을 전개용매로 하여 약 10cm 전개 시킨 다음 박층판을 바람에 말린다. 여기에 자외선 (주파장 254 nm)을 쪼이거나 분무용 드라겐도르프시액을 고르게 뿌릴 때 검액 및 표준액에서 얻은 반점의 Rƒ 값 및 색상은 같다.

플루오로메톨론·테트라히드로졸린염산염 점안현탁액

Fluorometholone and Tetrahydrozoline Hydrochloride Ophthalmic Suspension

확인시험 1)  플루오로메톨론  -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 에틸아세테이트 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 플루오로메톨론표준품 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------   (4 : 1 : 1) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

2) 테트라히드로졸린염산염  ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 에틸아세테이트 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------  ----- 메탄올·아세트산·물 (8 : 1 : 1) --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

플루페남산 캡슐

Flufenamic Acid Capsules

순도시험 유연물질 확인시험에서 얻은 잔류물의 5 % 클로로포름용액을 검액으로 하고 0.01 % 클로로포름용액을 만들어 표준액으로 한다. 이들 액을 가지고 박층크로마토그래프법에 따라 시험한다. 검액 및 표준액을 각각 10 μL씩을 박층크로마토그래프용실리카겔(형광제 첨가)을 써서 만든 박층판에 점적하고 톨루엔·디옥산·아세트산(100)혼합액 (90 : 25 : 1)을 전개용매로 하여 약 15 cm 전개한 다음 박층판을 바람에 말린다. 여기에 자외선(주파장 254 nm)을 쪼일때 검액에서 얻은 주반점 이외의 반점은 표준액에서 얻은 반점보다 진하지 않다.

플루페남산 캡슐

Flufenamic Acid Capsules

순도시험 유연물질 -------------------------------- 에탄올-------------------------- 에탄올------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 톨루엔․테트라히드로푸란․아세트산(100)혼합액 (90 : 25 : 1)-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.

피나베륨브롬화물

Pinaverium Briomide

정 량 법  이 약을 건조하여 약 0.6 g을 정밀하게 달아 비커에 넣고 비수적정용 아세트산에 녹인다. 비수적정용 아세트산수은(II)시액 5 mL 및 지시약으로 메틸로사닐린염화물시액 2 ∼ 3 방울을 넣고 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다. 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL

= 59.142 mg C26H41Br2NO4

피나베륨브롬화물

Pinaverium Briomide

정 량 법  이 약을 건조하여 약 0.45 g을 정밀하게 달아 비커에 넣고 무수포름산 2 mL를 가하고 아세트산탈수물 50 mL에 녹인 후 0.1 mol/L 과염소산으로 적정한다(적정종말점검출법의 전위차적정법). 같은 방법으로 공시험을 하여 보정한다.

0.1 mol/L 과염소산 1 mL

= 59.142 mg C26H41Br2NO4

피록시캄 주사액

Piroxicam Injection

정 량 법  이 약의 표시량에 대하여 피록시캄 (C15H13N3O4S) 40 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 50 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산메탄올시액을 넣어 50 mL로 한 다음 5.0 mL를 취하여 100 mL 용량플라스크에 넣고 이동상 용매를 넣어 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 피록시캄표준품 약 80 mg을 정밀하게 달아 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.01 mol/L 염산메탄올시액을 넣어 녹인 다음 검액과 같이 조작하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피록시캄의 피크 면적 AT 및 AS를 구한다.

피록시캄 (C15H13N3O4S)의 양 (mg)

= [eqn: 피록시캄표준품의~양~ rm (mg)~ TIMES ` {it A _{rm T it} rm} over {it A _{rm S it} rm} ` TIMES ` {1} over {2}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ～ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 70 % 메탄올

유  량 : 1.0 mL/분

피록시캄 주사액

Piroxicam Injection

정 량 법  이 약의 표시량에 대하여 피록시캄 (C15H13N3O4S) 40 mg에 해당하는 양을 정확하게 취하여 0.01 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 한 다음 5 mL를 취하여 이동상을 넣어 정확하게 100 mL로 하여 검액으로 한다. 따로 피록시캄표준품 약 40 mg을 정밀하게 달아 0.01 mol/L 메탄올성염산시액을 넣어 정확하게 50 mL로 하여 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 20 μL씩을 가지고 다음 조건으로 액체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 액의 피록시캄의 피크면적 AT 및 AS를 구한다.

피록시캄 (C15H13N3O4S)의 양 (mg)

= 피록시캄표준품의 양 (mg) [eqn: TIMES ` {it A _{rm T it} rm} over {it A _{rm S it} rm}]

조작조건

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 254 nm)

칼  럼 : 안지름 약 4 mm, 길이 약 30 cm인 스테인레스강관에 5 ∼ 10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.

이동상 : 완충액·메탄올·아세토니트릴 혼합액 (41 : 41 : 18)

유  량 : 1.0 mL/분

시스템적합성

시스템의 재현성 : 표준액 20 μL씩을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피록시캄의 피크면적의 상대표준편차는 2.0 % 이하이다.

◦ 완충액 : 무수시트르산 7.72 g을 물 400 mL에 녹이고 따로 인산이수소나트륨 5.36 g을 물 100 mL에 녹인다. 인산이수소나트륨용액과 시트르산용액을 합하고 물을 넣어 1000 mL로 하여 섞어 만든다.

박하유

Mentha Oil

정량법 (본문 생략)

멘톨 (C10H20O)의 양 (mg)

= l-멘톨표준품의 양 (mg) ×[eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}}]

박하유

Mentha Oil

정량법 (현행과 같음)

----------------------

--------------------[eqn: {Q _{rm T it}} over {Q _{rm S it}} TIMES {1} over {5}]

멸균주사용수

Sterile Water for Injection

주사제의 불용성이물시험  제1법으로 시험할 때 적합하여야 한다.

멸균주사용수

Sterile Water for Injection

불용성이물시험  시험할 때 적합하여야 한다.

26. 산소플라스크연소법

정량조작법 3) 플루오르 (전단생략) 플루오르 약 30 ng에 (이하 생략)

26. 산소플라스크연소법

정량조작법 3) 플루오르 (현행과 같음) 플루오르 약 30 μg에 (현행과 같음)

50. 잔류용매시험법

(생  략)

1. 분류 1 및 분류 2의 용매

(생  략)

시험방법

검액 및 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (I), 분류 2의 용매표준액 (II)을 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법의 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 크로마토그램으로부터 피크면적을 구한다. 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적보다 작고, 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적은 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배 보다 작다(제 1 단계 시험). 만약 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적과 같거나 큰 경우, 또는 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배와 같거나 큰 경우는 기체크로마토그래프 조작조건 제 2 법으로 다시 시험한다.  제 1 법에 따라 시험하였을 때 확인된 성분은 제 2 법에 따라 시험하였을 때 검액 중 그 성분의 피크면적은 표준액 중 해당 성분의 피크면적보다 작다(제 2 단계 시험). 만약 검액 중 해당 성분의 피크면적이 표준액 중 해당 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 검출된 성분에 대하여 검액, 성분별 표준액 및 표준액 첨가 검액을 가지고 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법으로 시험하여 검액 및 표준액 첨가 검액에서의 피크면적 AT 및 AST로부터 검액 중 잔류용매의 양을 계산한다(제 3 단계 시험).

<신  설>

2. 분류 3의 용매

(생  략)

50. 잔류용매시험법

(현행과 같음)

1. 분류 1 및 분류 2의 용매

(현행과 같음)

4) 시험방법

제 1 단계 시험

검액 및 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (I), 분류 2의 용매표준액 (II)을 기체크로마토그래피 조작조건 제 1 법의 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 크로마토그램으로부터 피크면적을 구한다. 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적보다 작고, 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적은 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배보다 작다.

제 2 단계 시험

제 1 단계 시험에서 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄을 제외한 각 성분의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액, 분류 2의 용매표준액 (1) 및 (II)의 각 성분의 피크 면적과 같거나 큰 경우, 또는 검액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크 면적이 분류 1의 용매 표준액 중 1,1,1-트리클로로에탄의 피크면적의 150 배와 같거나 큰 경우는 기체크로마토그래프 조작조건 제 2 법으로 다시 시험한다.  제 1 법에 따라 시험하였을 때 확인된 성분은 제 2 법에 따라 시험하였을 때 검액 중 그 성분의 피크면적은 표준액 중 해당 성분의 피크면적보다 작다.

제 3 단계 시험

제 2 단계 시험에서 검액 중 해당 성분의 피크면적이 표준액 중 해당 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 검출된 성분에 대하여 검액, 성분별 표준액 및 표준액 첨가 검액을 가지고 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법으로 시험하여 검액 및 표준액 첨가 검액에서의 피크면적 AT 및 AST로부터 검액 중 잔류용매의 양을 계산한다.

2. 분류 2 및 분류 3의 용매

장치

기체크로마토그래프

조작법

1) 표준액의 조제

가) 분류 2A 및 분류 3A의 용매 표준액의 조제

① 분류 2A의 용매 표준원액

아세토니트릴, 클로로벤젠, 크멘, 시클로헥산, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 1,4-디옥산, 메탄올, 메틸시클로헥산, 테트라히드로푸란, 톨루엔, 자일렌을 디메틸설폭시드에 녹여 아래 표와 같이 희석하여 분류 2A의 용매 표준원액으로 한다.

용매	조제 농도 (mg/mL)
아세토니트릴	2
클로로벤젠	1.7
크멘	0.3
시클로헥산	16
1,2-디클로로에텐	9
디클로로메탄	3
1,4-디옥산	1.8
메탄올	14.5
메틸시클로헥산	5
테트라히드로푸란	3.5
톨루엔	4
자일렌	10.5

② 분류 3A의 용매 표준원액

아세톤, 아세트산에틸, 디에틸에테르, 2-프로판올, 아세트산이소부틸, 2-부탄올 각 250 mg 씩 정밀하게 달아 각각 10 mL 용량플라스크에 넣고 디메틸설폭시드를 넣어 10 mL로 한다.

③ 분류 2A 및 분류 3A 용매 표준액

분류 2A의 용매 표준원액 1 mL를 정확하게 취해 100 mL 용량플라스크에 넣고 분류 3A의 용매 표준원액 1 mL를 넣은 다음 물을 넣어 100 mL로 하여 표준원액(I)으로 한다. 이액 1 mL 및 물 5 mL를 각각 취하여 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액(I)로 한다.

나) 분류 2B 및 분류 3B의 용매 표준액의 조제

① 분류 2B의 용매 표준원액

클로로포름, 1,2-디메톡시에탄, 헥산, 메틸부틸케톤, 니트로메탄, 피리딘, 테트랄린, 1,1,2-트리크로로에텐을 디메틸설폭시드에 녹여 아래 표와 같이 희석하여 분류 2B의 용매 표준원액으로 한다.

용매	조제 농도 (μg/mL)
클로로포름	60
1,2-디메톡시에탄	97
헥산	186
메틸부틸케톤	50
니트로메탄	49
피리딘	200
테트랄린	97
1,1,2-트리클로로에텐	78

② 분류 3B의 용매 표준원액

에탄올, 아세톤, t-부틸메틸에테르, 아세트산에틸, 1-부탄올 각 50 mg 씩 정밀하게 달아 각각 10 mL 용량플라스크에 넣고 디메틸설폭시드를 넣어 10 mL로 한다.

③ 분류 2B 및 분류 3B 용매 표준액

분류 2B의 용매 표준원액 1 mL를 정확하게 취해 100 mL 용량플라스크에 넣고 분류 3B의 용매 표준원액 1 mL를 넣은 다음 물을 넣어 100 mL로 하여 표준원액(II)로 한다. 이 액 5 mL 및 물 1 mL를 각각 취하여 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액 (Ⅱ)로 한다.

다) 성분별 표준액

시험방법 중 제 1 단계 및 제 2 단계 시험결과에 따라 검출된 성분에 대하여 표준원액 (I) 및 표준원액 (Ⅱ)의 농도를 참조하여 각 성분 표준품을 디메틸설폭시드에 녹인다(성분별로 각각 제조한다). 이 액 1 mL를 정확하게 취하여 물을 넣어 희석하고 단계별로 제 1 단계 및 제 2 단계 시험에서 검액에서 검출된 농도와 유사한 농도로 희석한다. 필요하면 ｢의약품잔류용매기준지침｣의 제한농도의 20 배까지 희석한다.

이 액 1 mL와 물 5 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 각 성분별 표준액으로 한다.

2) 검액의 조제

가) 검액 원액 : 검체 약 250 mg을 정밀하게 달아 물을 넣어 25 mL로 하여 검액 원액으로 한다.

나) 검액 : 검체 원액 5 mL와 물 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 검액으로 한다.

다) 표준액 첨가 검액 : 검체 원액 5 mL과 성분별 표준원액 1 mL를 헤드스페이스용 바이알에 넣고 골고루 섞은 것을 표준액 첨가 검액으로 한다.

3) 기체크로마토그래프 조작조건

조작조건 중에서 칼럼의 안지름 및 길이, 충전제의 입자경, 고정상의 농도, 칼럼온도 및 운반기체의 유량은 시스템적합성을 얻을 수 있는 범위 내에서 일부 변경할 수 있다. 또한, 분할비는 최적의 감도를 얻기 위해 변경할 수 있다. 다만 헤드스페이스용 검체도입장치 및 그 조작조건은 규정하는 방법보다 더 좋은 정확도와 정밀도를 얻을 수 있는 범위 내에서 변경할 수 있다.

가) 제 1 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 1.8 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름 0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 6 % 시아노프로필페닐 - 94 % 디메틸폴리실록산을 3.0 μm의 두께로 입힌다.

칼럼온도 : 30 ℃로 20 분간 유지한 다음 매분 10 ℃씩 240 ℃까지 승온하고 240 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

유량 : 약 20 cm/초

분할비 : 약 1 : 5

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도(℃)	80	105	80
평형시간(분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도(℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 도입구 온도(℃)	80~90	105~115	80~90
최소 가압 시간(초)	60	60	60
주입량(mL)	1	1	1

단, 잔류용매 각 성분의 유출순서는 다음과 같다.

1. 분류 2A 및 분류 3A의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	메탄올 (Methanol)	분류 2
2	디에틸에테르 (Diethyl ether)	분류 3
3	아세톤 (Acetone)	분류 3
4	2-프로판올 (2-Propanol)	분류 3
5	아세토니트릴 (Acetonitrile)	분류 2
6	디클로로메탄 (Methylene chloride)	분류 2
7	1,2-디클로로에텐 (trans-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
8	1,2-디클로로에텐 (cis-Dichloroethene)
9	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
10	테트라히드로푸란 (Tetrahydrofuran)	분류 2
11	2-부탄올 (2-Butanol)	분류 3
12	시클로헥산 (Cyclohexane)	분류 3
13	메틸시클로헥산 (Methyl cyclohexane)	분류 2
14	1,4-디옥산 (1,4-Dioxane)	분류 2
15	톨루엔 (Toluene)	분류 2
16	아세트산이소부틸 (Isobutyl acetate)	분류 3
17	클로로벤젠 (Chlorobenzene)	분류 2
18	에틸벤젠 (Ethyl benzene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
19	m-, p-자일렌 (m,p-Xylene)
20	o-자일렌 (o-Xylene)
21	크멘 (Cumene)	분류 2

2. 분류 2B 및 분류 3B의 용매

유출순서	잔류용매(분류 2B + 3)	비고
1	에탄올 (Ethanol)	분류 3
2	아세톤 (Acetone)	분류 3
3	t-부틸메틸에테르 (Methyl tert-butylether)	분류 3
4	헥산 (Hexane)	분류 2
5	니트로메탄 (Nitromethane)	분류 2
6	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
7	클로로포름 (Chloroform)	분류 2
8	1,2-디메톡시에탄 (1,2-Dimethoxyethane)	분류 2
9	1,1,2-트리클로로에텐 (1,1,2-Trichloroethene)	분류 2
10	1-부탄올 (1-Butanol)	분류 3
11	피리딘 (Pyridine)	분류 2
12	메틸부틸케톤 (Methylbutylketone)	분류 2
13	테트랄린 (Tetralin)	분류 2

시스템적합성

검출의 확인: 시스템적합성 용액에서 각 피크의 신호 대 잡음비는 10 이상이다.

시스템의 성능: 시스템적합성 용액을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피크면적의 상대표준편차는 10.0 % 이하이고, 인접한 피크와의 분리도는 1.5 이상이다. 다만, 2-프로판올 피크와 아세토니트릴 피크의 분리도는 1.0 이상이다.

◦ 시스템적합성 용액: 분석대상 잔류용매를 포함하여 최소 3개 이상의 용매를 선정하여 표준액의 제법과 같이 조제한다.

나) 제 2 법

검출기 : 불꽃이온화검출기

칼  럼 : 안지름 0.32 mm, 길이 30 m의 용융실리카관의 내면에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)을 0.25 μm의 두께로 입힌다. 또는 안지름  0.53 mm, 길이 30 m의 관에 기체크로마토그래프용 폴리에틸렌글리콜화합물(평균분자량 약 15,000)을 0.25 μm 두께로  입힌다.

칼럼온도 : 40 ℃로 20 분간 유지하고 다음 매분 6 ℃씩 165 ℃까지 승온하고 165 ℃로 20 분간 유지한다.

검체도입부온도 : 140 ℃

검출기온도 : 250 ℃

운반기체 : 헬륨 또는 질소

분할 비 : 약 1 : 5

유량 : 약 20 cm/초

헤드스페이스용 검체도입장치 조건 : 다음 중 한 가지 조건에 따른다.

	조건 1	조건 2	조건 3
평형온도(℃)	80	105	80
평형시간(분)	60	45	45
검체도입부와 연결관 온도(℃)	85	110	105
헤드스페이스용바이알 도입구 온도(℃)	80∼90	105∼115	80∼90
최소 가압 시간(초)	60	60	60
주입량(mL)	1	1	1

단, 잔류용매 각 성분의 유출순서는 다음과 같다.

1. 분류 2A 및 분류 3A의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	디에틸에테르 (Diethyl ether)	분류 2
2	시클로헥산 (Cyclohexane)	분류 3
3	메틸시클로헥산 (Methyl cyclohexane)	분류 2
4	아세톤 (Acetone)	분류 3
5	테트라히드로푸란 (Tetrahydrofuran)	분류 2
5	1,2-디클로로에텐 (trans-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
6	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
7	메탄올 (Methanol)	분류 2
8	디클로로메탄 (Methylene chloride)	분류 2
9	2-프로판올 (2-Propanol)	분류 3
10	1,2-디클로로에텐 (cis-Dichloroethene)	분류 2 1,2-Dichloroethene =trans-Dichloroethene + cis-Dichloroethene
11	아세토니트릴 (Acetonitrile)	분류 2
12	이소부틸아세테이트 (Isobutyl acetate)	분류 3
13	톨루엔 (Toluene)	분류 2
14	2-부탄올 (2-Butanol)	분류 3
15	1,4-디옥산 (1,4-Dioxane)	분류 2
16	에틸벤젠 (Ethyl benzene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
17	p-자일렌 (p-Xylene)
18	m-자일렌 (m-Xylene)
19	크멘 (Cumene)	분류 2
20	o-자일렌 (o-Xylene)	분류 2 자일렌 (Xylenes) = Ethyl benzene + m-Xylene + p-Xylene + o-Xylene
21	클로로벤젠 (Chlorobenzene)	분류 2

2. 분류 2B 및 분류 3B의 용매

유출순서	잔류용매	비고
1	헥산 (Hexane)	분류 2
2	t-부틸메틸에테르 (Methyl tert-butylether)	분류 3
3	아세톤 (Acetone)	분류 3
4	아세트산에틸 (Ethyl acetate)	분류 3
5	1,2-디메톡시에탄 (1,2-Dimethoxyethane)	분류 2
6	에탄올 (Ethanol)	분류 3
7	1,1,2-트리클로로에텐 (1,1,2-Trichloroethene)	분류 2
8	클로로포름 (Chloroform)	분류 2
9	메틸부틸케톤 (Methylbutylketone)	분류 2
10	니트로메탄 (Nitromethane)	분류 2
11	1-부탄올 (1-Butanol)	분류 3
12	피리딘 (Pyridine)	분류 2
13	테트랄린 (Tetralin)	분류 2

시스템적합성

검출의 확인: 시스템적합성 용액에서 각 피크의 신호 대 잡음비는 10 이상이다.

시스템의 성능: 시스템적합성 용액을 가지고 위의 조건으로 시험을 6 회 반복할 때 피크면적의 상대표준편차는 10.0 % 이하이고, 인접한 피크와의 분리도는 1.5 이상이다. 다만, p-자일렌 피크와 m-자일렌 피크의 분리도는 1.0이상이다.

◦ 시스템적합성 용액: 분석대상 잔류용매를 포함하여 최소 3 개 이상의 용매를 선정하여 표준액의 제법과 같이 조제한다.

4) 시험방법

제 1 단계 시험

검액, 표준액 (I) 및 표준액 (II)를 기체크로마토그래피 조작조건 제 1 법의 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 각 크로마토그램으로부터 피크면적을 구한다. 검액 중 각 성분의 피크면적이 표준액 (I) 및 표준액 (II)의 각 성분의 피크면적보다 작다.

제 2 단계 시험

제 1 단계 시험에서 검액 중 각 성분의 피크면적이  표준액 (I) 및 표준액 (II)의 각 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 기체크로마토그래프 조작조건 제 2 법으로 다시 시험한다. 제 1 법에 따라 시험하였을 때 확인된 성분은 제 2 법에 따라 시험하였을 때 검액 중 그 성분의 피크면적은 표준액 중 해당 성분의 피크면적보다 작다.

제 3 단계 시험

제 2 단계 시험에서 검액 중 해당 성분의 피크면적이 표준액 중 해당 성분의 피크면적과 같거나 큰 경우는 검출된 성분에 대하여 검액, 성분별 표준액 및 표준액 첨가 검액을 가지고 기체크로마토그래프 조작조건 제 1 법으로 시험하여 검액 및 표준액 첨가 검액에서의 피크면적 AT 및 AST로부터 검액 중 잔류용매의 양을 계산한다.

검액 중 잔류용매의 양(ppm) =

[eqn: {LEFT ( C ``TIMES `n RIGHT )} over {W} ` TIMES ` LEFT [ {A _{rm T}} over {LEFT ( A _{rm ST} ``-`A _{rm T} RIGHT )} RIGHT ]]

C : 표준액의 농도 (μg/mL)

W : 검체 채취량 (g)

n : 표준원액에서부터의 희석배수

3. 분류 3의 용매

(현행과 같음)

<신  설>

67. 총단백질정량법

단백질을 정량하는 방법은 단백질을 구성하고 있는 아미노산들의 자외부흡광과 같은 단백질 자체의 물리적 특성을 이용하는 방법과 특정물질과 단백질간의 화학반응을 통해 흡광파장을 가시광선부 범위내로 변화시킨 후 흡광도를 측정하는 방법이 있다. 가시광선흡광측정의 경우, 화학반응 정도는 단백질의 양에 비례하게 되며 발색반응이기 때문에 흡광도가 증폭되어 민감도가 증가하는 장점이 있다.

자외선 흡광도법  용액 중 단백질은 단백질 구조상 주로 티로신과 트립토판과 같은 방향족 아미노산에 의해 280 nm의 파장에서 자외선을 흡수한다. 이러한 특성을 이용하여 용액 속의 단백질을 정량할 수 있다. 단백질을 녹이기 위해 사용되는 완충액이 물에 비해 상대적으로 높은 흡광도를 갖는다면 완충액 내에는 간섭물질이 존재하는 것이다. 이러한 간섭 작용은 완충액을 보정액으로 사용하여 제거하거나 최소화할 수도 있지만 간섭물질이 높은 흡광도를 나타낸다면 적절한 결과를 얻지 못할 수 있다. 측정하고자 하는 단백질 농도가 낮으면 셀 (cell)에 단백질이 흡착되어 측정값이 현저히 감소될 수 있다. 이것은 단백질 농도를 높이거나 완충액을 만들 때 비이온성 계면활성제를 사용하여 해결할 수 있다.

조작법  측정하는 동안 검액, 표준액 및 보정액을 같은 온도로 유지한다. 조제된 완충액을 보정액으로 이용하고 검액과 표준액을 석영 셀에 넣은 후 280 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정된 단백질 농도의 값은 해당 흡광도가 직선으로 된 검량선 구간에 있을 때 정확한 값을 구할 수 있다.

1) 검액  측정할 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 단백질 농도가 0.2 〜 2 mg/mL가 되도록 한다.

2) 표준액  측정할 표준물질을 검액 조제시 사용한 완충액으로 희석하여 검액의 단백질 농도와 동일하게 만든다.

광산란  검체에 의한 광산란으로 인해 단백질의 자외선분광측정의 정확성이  감소될 수 있다. 용액 중 단백질이 분석에 사용되는 파장과 비슷한 크기(250 nm ∼ 300 nm)라면 산란으로 인해 검체의 흡광도가 명백히 증가하게 된다. 280 nm에서 광산란에 의한 흡광도를 계산하기 위해 320 nm, 325 nm, 330 nm, 335 nm, 340 nm, 345 nm 및 350 nm 파장에서 검액의 흡광도를 측정하고 이 측정값들의 로그값과 각 측정 파장의 로그값으로 그래프를 그린다. 다음으로 선형희귀에 의해 그래프 상의 좌표값들을 가장 잘 반영하는 표준곡선을 그린다. 이 곡선을 외삽하여 280 nm에서의 흡광도 로그값을 계산한 후 그 진수(antilogarithm value)를 구하면 이 값이 280 nm에서 광산란에 의한 흡광도가 된다. 280 nm에서 측정된 총 흡광도에서 광산란에 의한 흡광도를 빼서 보정한 값이 용액 내의 단백질의 흡광도이다. 특히 용액이 현저히 혼탁할 경우 단백질 흡착이 안 되는 0.2 μm 여과막을 사용하여 여과하거나 원심분리를 이용하여 광산란에 의한 영향을 감소시킬 수 있다.

계산법  검액 내 단백질 농도는 다음 식으로 보정값을 이용하여 구한다. 필요한 경우 흡광계수를 적용할 수 있다.

CU = CS(AU/AS)

CU : 검액 중 단백질 농도

CS : 표준액 중 단백질 농도

AU : 검액의 보정된 흡광도 값

AS : 표준액의 보정된 흡광도 값

로리법  로리법은 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액 또는 폴린시오칼토페놀시액)내 인몰리브덴산텅스텐 혼합산 색소원(chromogen)이 단백질에 의해 환원되고 이로 인한 발색이 750 nm 파장에서 최대 흡광도를 보이는 원리를 이용한 방법이다. 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액)은 단백질 내 티로신잔기와 주로 반응하여 상온에서 20 〜 30분간 발색되었다가 서서히 발색이 사라진다. 이 방법은 간섭물질에 민감하기 때문에 검체로부터 단백질을 침전시킨 후 사용한다. 대부분의 간섭 물질은 발색을 감소시키지만 일부 계면활성제는 발색을 약간 증가시킨다. 고농도의 염은 인몰리브덴산텅스텐산과 단백질 결합체를 침전시킬 수 있다. 단백질의 종류에 따라 다른 강도의 발색 반응을 나타낼 수 있어, 가능한 표준물질과 검체는 동일한 종류의 단백질을 사용한다. 표준물질이 따로 없을 경우에는 단백질정량용 알부민 등으로 대체한다. 검체 내에 단백질로부터 간섭물질을 분리하고자 할 경우 검액을 준비하기 전에 간섭물질을 아래의 간섭물질 제거 방법에 따라 분리한다. 정확한 측정을 위해 검체가 충분히 고농도일 경우에는 희석배수를 높여 간섭물질의 영향을 최소화할 수 있다.

조작법  알칼리성구리시액 1 mL를 각각 1 mL의 표준액, 검액 및 공시험액에 가한 후 진탕 혼합한다. 10 분간 정치시킨 후 인몰리브덴산텅스텐산시액 희석액 0.5 mL를 가하고 진탕 혼합한 다음, 30 분간 상온에서 정치시킨 후 공시험액을 보정액으로 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정한다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준곡선 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다. 완충액 내 적정 pH 범위는 10.0 ∼ 10.5이다.

2) 표준액  조제된 완충액에서 단백질이 측정되도록 표준액을 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질함량 5 〜 100 μg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 황산구리시액  황산구리 100 mg과 타르타르산나트륨 0.2 g을 물로 녹여 50 mL가 되게 희석한다. 무수탄산나트륨 10 g을 물로 녹여 50 mL가 되게 한다. 천천히 탄산나트륨용액을 황산구리용액에 가하여 진탕 혼합한 다음 24시간 이내에 사용한다.

5) 알칼리성구리시액  황산구리시액․도데실황산나트륨액 (50 g/L)․ 수산화나트륨액 (32 g/L)혼합액(1 : 2 : 1)을 상온에서 보관하고 2주 이내에 사용한다.

6) 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액)  물 700 mL에 텅스텐산나트륨 100 g 및 몰리브덴산나트륨 25 g을 넣어 녹이고 염산 100 mL 및 인산 50 mL를 넣고 환류냉각기를 달아 10 시간 동안 가열한다. 이것에 황산리튬 150 g, 물 50 mL 및 브롬 몇 방울을 넣고 과량의 브롬을 제거하기 위해 약 15 분간 끓인다. 식힌 다음 물을 넣어 1000 mL로 하고 여과한다. 이 시액은 노란색이다. 초록색조가 나타나면 적합하지 않으며 이러한 경우는 브롬 몇 방울을 넣고 다시 끓여서 재생할 수 있다.

7) 폴린시액 (인몰리브덴산텅스텐산시액) 희석액  폴린시액 5 mL을 물 55 mL로 혼합한 다음, 황갈색 병에 옮긴 후 상온에서 보관한다.

8) 데옥시콜산-트리클로로아세트산  데옥시콜산나트륨․트리클로로아세트산혼합액(1 : 1)

데옥시콜산나트륨  데옥시콜산나트륨 150 mg을 물 100 mL에    녹여 1.5 g/L로 한다.

트리클로로아세트산  트리클로로아세트산 72 g에 물 100 mL에   녹여 720 g/L로 한다.

간섭물질  간섭물질을 제거하기 위해 측정 전 검체에 데옥시콜산-트리클로로아세트산을 가하여 단백질을 침전시킨 후 측정할 수 있다. 이 방법은 희석액으로부터 단백질을 농축시키는데 사용된다.

측정할 검체에 데옥시콜산나트륨액 0.1 mL (1.5 g/L)를 가한 다음 교반기로 교반시킨 후 10 분간 상온에 정치시킨다. 다시 트리클로로아세트산 0.1 mL (720 g/L)를 가한 후 교반기로 교반시킨다. 그 다음 3000 g에서 30 분간 원심 분리한다. 상층액을 버리고 잔류된 액은 파이펫으로 제거한다. 단백질 침전물은 1 mL 알칼리성구리시액을 가하여 다시 녹인다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 표준액의 단백질농도와 흡광도간 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 단백질 농도를 결정한다.

브래드포드법  이 방법은 산 블루 90 색소가 단백질과 결합하여 최대흡광파장이 470 nm에서 595 nm로 이동하는 원리를 이용한 것이다.

산 블루 90 색소는 단백질 내 아르기닌 및 리신 잔기에 가장 쉽게 결합한다. 따라서 단백질에 따라 시험반응이 다양할 수 있어 반드시 같은 종류의 단백질을 표준물질로 사용하여 검체의 단백질 함량을 측정해야 한다. 이 방법은 상대적으로 간섭물질의 영향을 거의 받지 않지만 검체 내에 계면활성제와 양성전해질이 있는 것은 피해야 한다. 강한 알칼리성 검체는 산성시액의 반응을 방해할 수 있다.

조작법  산 블루 90 시액 5 mL를 각각 0.1 mL의 표준액, 검액 및 공시험액에 가한 다음 상하로 교반하여 혼합한다. 이때 거품이 생기지 않도록 한다. 거품형성은 재현성을 떨어트릴 수 있다. 공시험액을 보정액으로 사용하여 595 nm에서 표준액과 검액의 흡광도를 측정한다. 색소가 석영에 결합할 수 있기 때문에 석영 셀을 사용하지 않는다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준곡선 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다.

2) 표준액  조제된 완충액에서 단백질이 측정되도록 표준액을 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질함량 0.1 〜 1 mg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 산 블루 90 시액  산 블루 90 0.1 g을 알코올로 녹여 50 mL가 되게 한다. 그 다음 이 용액에 100 mL 인산을 가한 후 물로 1000 mL가 되게 희석하여 혼합한다. 용액을 여과 후 황갈색 병에 옮긴 후 상온에서 보관한다. 보관 시 색소가 천천히 침전하므로, 여과하여 사용한다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 단백질 농도를 결정한다.

비신코닌산법(BCA법) 비신코닌산법은 단백질에 의해 2가 구리이온(Cu2+)이 1가 구리이온(Cu1+)으로 환원되는 반응을 이용한다. 비신코닌산시액은 1가 구리이온(Cu1+)을 검출하기 위해 사용한다. 이 방법은 간섭물질의 영향을 거의 받지 않지만 검체 내에 간섭물질이 있을 경우 간섭물질의 영향은 희석에 의해 최소화 시킬 수 있다. 하지만 검체 단백질 농도는 정확한 측정을 위해 충분한 양이 있어야 한다. 다른 방법으로는 로리법처럼 검체로부터 단백질을 침전시켜 간섭물질을 제거시킬 수 있다. 단백질 종류에 따라 다른 발색정도를 나타낼 수 있어 표준물질 단백질과 검체 단백질은 동일 종류여야 한다.

조작법  구리-비신코닌산시액 2 mL를 각각 0.1 mL의 표준액, 검액 및 완충액에 가하여 혼합한 다음 37 ℃에서 30 분간 둔다. 시간을 기록하고 상온까지 혼합물을 식히는 것이 허용된다.

반응 종료 후 60 분 이내에 반응액을 석영 셀에 옮긴 후 공시험액을 보정액으로 사용하여 562 nm에서 흡광도를 측정한다. 반응액 온도가 상온으로 되면 발색 강도는 점차적으로 증가된다.

1) 검액  적당량의 검체를 조제된 완충액으로 희석하여 표준액 농도 범위 안에 들어갈 수 있도록 만든다.

2) 표준액  측정할 표준물질을  완충액으로 녹인다. 동일한 완충액으로 희석하여 단백질 함량 10 〜 1200 μg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 5개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  검액과 표준액을 만들기 위해 사용되는 완충액을 사용한다.

4) 비신코닌산시액(BCA시액)  비신코닌산이나트륨 (disodium bicinchoninate) 10 g, 탄산나트륨1수화물 20 g, 타르 타르산나트륨 1.6 g, 수산화나트륨 4 g, 탄산수소나트륨 9.5 g을 물에 녹인 후 필요시 수산화나트륨용액이나 탄산수소나트륨용액을 가하여 pH를 11.25가 되도록 조절한 다음, 물을 가하여 1 L가 되게 한다.

5) 구리-비신코닌산시액 황산구리용액 (4 g/L) 1 mL와 비신코닌산시액 50 mL를 혼합한다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 비선형적이지만, 농도 구간이 충분히 좁을 경우 선형에 근접하게 되어 직선형 표준곡선을 얻을 수 있다. 이와 같은 원리를 적용하여 우선 선형회귀를 사용하여 구한 표준곡선(검량선)과 검액의 흡광도로부터 검액 중 단백질 농도를 결정한다.

뷰렛법  이 방법은 알칼리성 조건에서 2가 구리이온(Cu2+)을 단백질 용액과 반응시켰을 때, 발색 반응을 545 nm의 흡광도에서 측정하는 것이다. 이 분석법은 타분석법과 달리 단백질 종류가 달라도 발색정도의 차이가 매우 작다. 예를 들어 동량의 면역글로불린-G와 알부민 검체를 측정 시에 측정결과의 차이가 거의 없다. 그렇지만 뷰렛시액에 수산화나트륨용액을 가할 때 충분히 혼합되지 않을 경우와 혼합 후 반응시간이 길어진 경우에는 면역글로블린-G가 알부민보다 높은 흡광도를 나타낼 수 있기에 이러한 점들은 주의해야한다. 검체 내 간섭물질의 영향을 최소화하기 위해 트리클로로아세트산을 가하여 500 μg/mL 미만의 검체 중 단백질 농도로 측정할 수도 있다.

조작법 검액, 표준액 및 공시험액에 동량의 수산화나트륨용액 (60 g/L)을 가한 후 혼합한다. 이 혼합액에서 검액의 0.4 배 용량만큼 뷰렛시액을 가하고 바로 혼합한다. 15 〜 25 ℃ 온도 조건에서 적어도 15 분 이상 반응시킨다. 표준액과 검액에 뷰렛시액을 가하고 90 분 이내에 공시험액을 보정액으로 사용하여 545 nm에서 최대흡광도를 측정한다. 단백질 농도 측정시 시액이 혼탁해지거나 침전물이 생긴 경우 사용하지 않는다.

1) 검액  적당량의 검체를 염화나트륨용액 (9 g/L)으로 희석하여 표준액 농도 범위 안에 들어갈 수 있도록 검액을 만든다.

2) 표준액  표준물질을 염화나트륨용액 (9 g/L)에 녹인 후, 희석하여 단백질 함량 0.5 〜 10 mg/mL 적정 범위 내에서 균등하게 농도가 분포하도록 최소한 3개 농도의 표준액을 만든다.

3) 공시험액  염화나트륨용액 (9 g/L)을 사용한다.

4) 뷰렛시액  황산구리 3.46 g을 뜨거운 물로 녹여 10 mL가 되도록 하고 차갑게 식혀 용액 A를 만들고, 시트르산나트륨 (이수화물) 34.9 g과 무수탄산나트륨 20.0 g을 뜨거운 물로 녹이고 식혀서 용액 B를 만든다. 용액 A와 용액 B를 혼합 후 물로 희석하여 200 mL가 되도록 한다. 이 혼합액은 6개월 이내에 사용한다. 만약 시액이 혼탁해지거나 침전물이 생길 경우 사용하지 않는다.

계산법  흡광도와 단백질 농도 간의 관계는 제시된 표준액 구간에서 대략 선형이다. 단백질 농도와 표준액의 흡광도간 선형회귀를 사용하여 표준곡선을 그릴 수 있다. 이때 표준곡선(검량선)의 상관계수를 구할 수 있고 적어도 0.99 이상이어야 적절하다. 표준곡선과 검액의 흡광도로부터 검액 중 단백질 농도를 결정한다.

간섭물질  간섭물질의 영향을 최소화하기 위해 검체 내 단백질은 다음과 같이 침전시키고 사용할 수 있다. 검액 용량 대비 0.1 배의 트리클로로아세트산용액 (500 g/L)을 가한 후, 원심 분리하여 상층액을 버리고 침전물은 소량의 수산화나트륨용액 (0.5 mol/L)으로 녹인다.

<신  설>

68. 크기배제 액체크로마트그래프법

크기배제 액체크로마토그래프법은 분자의 크기 차이를 이용하여 용액 내 물질을 분리하는 방법이다. 이동상 용매에 따라 유기용매를 사용하는 방법을 겔침투크로마토그래프법, 수용성용매를 이용하는 방법을 겔여과크로마토그래프법이라고 한다. 물질 분리 원리는 다공성 겔을 칼럼에 충전하고 여기에 시료를 주입한 후 이동상을 흘려보내면 겔 입자 내에서 이동상 용매와 고정상의 동일 용매 사이의 용질 분자의 반복적 교환에 의해 분자크기에 따른 분리가 일어나고 충전된 겔의 공극 (pore) 크기가 분리되는 분자량 범위를 결정한다.

특정 크기의 공극을 가진 겔에서 충분히 작은 분자는 겔 사이의 공간과 공극내 공간 (겔 총 침투용적, Vt)을 모두 통과한 후 용출된다. 즉 이동상이 겔 총 침투용적 (Vt)만큼 흐른 후 용출되게 된다. 하지만 매우 큰 크기의 분자는 공극내 공간에 머무르지 못하고 겔 사이의 공간 (배제용적, Vo)만을 통과하여 용출된다. 즉 이동상이 배제용적 (Vo)만큼 흐른 후 용출되게 된다. 그리고 중간 크기의 분자들은 이동상이 겔 총 침투용적 (Vt)과 배제용적 (Vo)사이의 어느 용적 (부피)만큼 흐른 후 용출된다. 일반적으로 물질의 분리는 겔 총 침투용적과 배제용적 사이 첫 2/3 정도에서 일어난다.

기본이 되는 장치는 다양한 길이와 내경을 갖는 칼럼이다. 칼럼은 필요에 따라 온도를 조절할 수 있고 적절한 분자크기 범위 내에서 물질을 분리할 수 있으며 일정한 속도로 유출 조절이 되어야 한다. 칼럼 한쪽 끝은 유입부로, 검체를 주입할 수 있는 주입구 같은 적절한 장치와 용출을 조절할 수 있는 펌프가 연결되어야 한다. 반대쪽 끝은 유출부로, 검체를 분리하여 조성물별로 상대적 농도를 측정할 수 있는 검출기에 연결되어야 한다.

검출기는 일반적으로 흡광도, 굴절도, 발광 등의 특성을 이용한다. 필요시 자동 분획수집기를 부착할 수도 있다. 컬럼은 팽윤된 젤과 같은 부드러운 물질 또는 유리, 실리카나 유리 고분자 물질과 같은 단단한 물질로 충전된다. 단단한 물질로 충전된 컬럼은 높은 압력을 발생시키는 펌프 시스템을 사용하기 때문에 신속한 분리에 유리하다. 이동상은 검체종류, 분리매체, 검출방법에 의해 선택된다.

분리를 수행하기에 앞서, 충전제는 의약품 각조의 규정 또는 제조사의 지침에 따라 전처리하여 칼럼에 충전할 수도 있다. 크로마토그래프법은 분리방법에 따라 시스템 적합성을 적절히 평가한다.

혼합물의 상대적 조성 측정 의약품 각조의 규정을 따라 분리과정을 수행한다. 만약, 분석하고자 하는 모든 성분들이 동일한 반응성을 나타내는 물리화학적 특성으로 시료를 분석한다면(예를 들어, 분석하고자 하는 성분들이 동일한 비흡광도(specific absorbance)를 갖고 있다면), 개별 성분의 피크 면적을 모든 성분들의 피크 면적 총합으로 나누어 그 성분의 상대적인 양을 구할 수 있다. 그러나 만약 검출을 위해 사용되는 물리화학적 특성의 농도-반응성이 분석하고자 하는 성분들 간에 같지 않다면, 의약품 각조에 규정된 교정용 표준품을 사용하여 얻은 검량선을 이용하여 함량을 계산한다.

분자량 측정  크기배제 액체크로마토그래프법은 의약품 각조에 규정된 적절한 교정용 표준품과 비교하는 방법으로 분자량을 측정하는데 사용될 수 있다. 이를 위해 우선 교정용 표준품의 분자량 로그값 및 유지용적간 그래프를 그리게 되는데 이 경우 대개 그래프는 배제용적과 총 침투용적 내에서 직선이 되며, 이 검량선을 이용하여 분자량을 결정한다. 이와 같은 분자량 결정에서 유의할 점은 실험조건이나 용질/용매 시스템이 달라진다면 이전 검량선은 더 이상 유효하지 않다는 점이다.

고분자물질의 분자크기에 따른 분포도 측정 크기배제 액체크로마토그래프법은 고분자물질의 분자 크기에 따른 분포도를 측정하는데 사용될 수 있다. 그러나 시료간 비교는 동일한 실험 조건하에서 얻어진 결과에 대해서만 유효하다. 교정에 사용되는 표준품과 고분자물질의 분자크기의 분포도를 측정하는 방법은 의약품 각조의 규정을 따른다.

<신  설>

69. 펩티드 지도작성법

펩티드 지도작성법은 유전자재조합 단백질의 확인시험에 사용되는 분석법으로 효소적 또는 화학적 방법으로 단백질을 절단하여 얻은 펩티드 조각을 분리하여 확인하는 방법이다. DNA에 암호화되어있는 유전정보의 번역과정이나 돌연변이에 의해 아미노산 서열에 변화가 생길 경우, 단백질 절단에 의해 만들어지는 펩티드 조각에 변화가 생길 수 있다. 따라서 펩티드 지도는 분석단백질의 일차구조상의 변화를 반영하는 일종의 단백질 지문 같은 정보를 제공한다. 이 같은 특성 때문에 펩티드 지도작성법은 제조공정의 일관성이나 유전적 안정성을 입증할 수 있는 비교 분석법으로 활용된다. 펩티드 지도작성 과정에는 의약품에 포함된 단백질의 분리 및 정제, 펩티드 결합의 선택적 절단, 크로마토그래프법을 이용한 펩티드의 분리, 펩티드의 분석 및 확인의 4가지 주요단계가 필요하다. 이 과정에서 시료는 동일하게 처리된 표준물질과 비교분석되는데 특히 정확한 분석을 위해서는 절단 반응이 완전하게 일어나는 것이 중요하다. 보통 화학절단제 보다는 트립신과 같은 효소를 사용할 때 절단이 더 잘 이루어진다.  의미 있는 지도 작성을 위해서는 충분한 수의 펩티드 절단조각이 얻어져야 하지만 절단조각이 너무 많으면 많은 단백질들이 같은 양상을 나타내어 지도의 특이성이 없어질 수도 있다. 따라서 펩티드 지도작성법은 각 단백질이 갖고 있는 고유특성에 대한 이해를 바탕으로 특이성을 충분히 가지도록 개발되어야 한다.

단백질의 분리 및 정제  원료의약품 및 완제의약품을 분석하는 경우, 분석을 방해하는 부형제나 부형단백질이 포함되어 있어 분리와 정제 과정이 필요하다. 필요한 경우 의약품 각조에 규정된 방법에 따라 시험할 수 있다. 또한 필요시 제형으로부터 단백질의 정량적 회수도 확인할 수 있다.

펩티드결합의 선택적 절단  시험할 단백질의 특성에 따라 단백질의 적절한 절단방식을 결정하고, 그 범주 내에서 절단제 종류를 선택한다. 여러 절단제와 이들의 특징은 표 1에 제시되어 있으며 기술 발달에 따라 사용가능한 절단제는 더 추가될 수 있다. 트립신과 같은 절단제를 사용하는 경우 너무 많은 펩티드 조각이 생성된다면 시료 단백질의 리신 잔기를 시트라코닐화나 말레일화시켜야 한다. 이와 같은 시료 전처리 외에 절단제를 전처리해야 하는 경우도 있는데 예를 들어 트립신을 사용할 때, 미량으로 들어 있는 키모트립신으로 인해 펩티드 지도의 재현성이 손상되는 것을 막기 위해 효소저해제(TPCK, tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)를 처리하여 키모트립신을 불활성화시키거나 크로마토그래피법으로 트립신만을 분리하여 사용하기도 한다.

표 1. 펩티드 지도 작성용 절단제
형태	절단제	특이성
효소 절단제	트립신 (EC 3.4.21.4)	아르기닌과 리신 C-말단
	알파키모트립신 (EC 3.4.21.1)	소수성 부위의 C-말단 (예, 리신, 메티오닌, 알라닌, 방향족)
	펩신 (EC 3.4.23.1 및 EC 3.4.23.2)	비특이적 분해
	리신엔도펩티다제 (EC 3.4.21.50)	리신의 C-말단
	글루타민산엔도펩티다제 (EC 3.4.21.19)	L-글루타민산과 아스파라긴산의 C-말단
	펩티딜-아스파라긴산-메탈로엔도펩티다제 (EC 3.4.24.33)	아스파라긴산의 N-말단
	클로스트리페인 (EC 3.4.22.8)	아르기닌의 C-말단
화학 절단제	시안화브롬	메티오닌의 C-말단
	2-니트로-5-티오시아노벤조산	시스틴의 N-말단
	o-요오드벤조산	트립토판과 티로신의 C-말단
	묽은 산	아스파라긴산과 프롤린
	BNPS-스케톨	트립토판

1) 단백질의 전처리  시료를 농축하거나 또는 단백질 제형에 사용된 부형제나 안정제가 펩티드 지도작성에 방해가 된다면 시료로부터 분석할 단백질을 분리하는 것이 필요하며 이를 위한 물리적 전처리 방법으로는 한외여과법, 칼럼크로마토그래프법, 동결건조법 등이 있다. 다른 한편 절단 효소를 처리하기 전에 효소를 절단부위에 충분히 접근시키기 위해 단백질의 접힘을 풀어야 하는데 이를 위해 요소와 같은 수소결합 해리제를 사용하여 디설피드 결합을 환원하거나 알킬화시킨다. 그리고 트립신으로 분해할 경우, 트립신 자체가 자가분해되어 분석에 영향을 주는 피크가 생길 수도 있기 때문에 이를 막기 위해 분해완충액을 이용하여 희석하기 전까지 효소는 자체활성을 위한 최적 pH가 아닌 용액조건(예, 트립신 사용시, pH 5)에서 준비하고, 분해 반응시 트립신과 단백질간 비를 적절히 조절한다.

2) 최적 분해 조건 설정 일반적으로 화학적 또는 효소적 반응에 영향을 줄 수 있는 모든 인자들은 단백질 분해 과정에도 영향을 줄 수 있으므로, 최적 분해 조건 설정은 중요하다.

가) 반응 pH  절단제의 활성을 최적화할 수 있는 분해용액의 pH는 경험적으로 결정한다. 예를 들면, 절단제로 시안화브롬을 사용할 경우에는 pH 2와 같은 강산 조건이 필요하며, 트립신을 사용할 때는 pH 8과 같은 약알칼리성 조건이 최적이다. 또한 일반적으로 최적의 분해를 위해 pH는 반응 중에 일정하게 유지되어야 한다.

나) 반응온도  대부분 분해온도는 25 ∼ 37 ℃ 사이가 적절하지만 분해조건에 맞게 최적온도를 설정할 수 있다. 어떤 단백질들은 반응 온도가 증가하면서 쉽게 변성되기 때문에 시험 단백질의 종류에 따라 적절한 반응온도를 결정하여 화학적 부반응을 최소화하여야 한다. 예를 들면, 유전자재조합 소마트로핀을 고온에서 분해할 경우, 침전되기 때문에 4 ℃에서 실시한다.

다) 반응시간  시료가 충분하다면 재현가능한 펩티드 지도를 얻으면서 불완전분해를 피할 수 있는 최적시간 탐색 연구를 실시한다. 분해시간을   2 ∼ 30 시간으로 변화하면서, 지도작성을 방해하지 않는 산을 첨가하거나 또는 냉동함으로써 반응을 멈추게 할 수 있다.

라) 절단제의 양  과량의 절단제를 사용하여 신속히 분해 (6 ∼ 12 시간) 시키는 경우라도, 그 사용량은 크로마토그래프법의 지도 양상에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 최소화되어야 한다. 일반적으로 단백질 : 단백질 절단제의 비는 20 : 1 ∼ 200 : 1 사이를 사용하는데, 온도 및 반응 시간에 따라 단백질과 절단제의 반응비는 다양하게 설정될 수 있다. 분석 중 간섭현상을 일으킬 수 있는 인위적 분해요소들을 걸러내기 위해, 분해대조액은 시험 단백질을 제외한 모든 성분이 포함된 공시험액을 사용한다.

크로마토그래프법에 의한 분리 분석 단백질 특성에 따라 적절한 지도작성 방법을 선택한다. 펩티드를 성공적으로 분리하는 검증된 방법들은 표 2와 같으며, 아래 내용에서는 주로 역상액체크로마토그래프법에 대해 기술하였다.

표 2. 펩티드 분리 방법

역상액체크로마토그래프법

이온교환크로마토그래프법

소수성크로마토그래프법

폴리아크릴아미드겔 전기영동법(비환원성)

도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동법

모세관전기영동법

고전압종이크로마토그래프법

고전압종이전기영동법

용매와 이동상의 순도는 액체크로마토그래프법을 이용한 분리시 매우 중요한 요소이다. 필요시 액체크로마토그래프법에 사용되는 전용 용매와 정제수를 구입해서 사용할 수 있다. 단일 용매보다 혼합 용매 사용시, 용존 기체는 농도기울기 분리에서 문제가 발생될 수 있으므로 필요한 경우, 탈기(예, 진공처리, 초음파처리)하여 사용한다. 용매 내 고형물도 액체크로마토그래프 장치에 유입되면 펌프밸브의 봉합부위에 손상을 주거나 칼럼을 막을 수 있으므로, 여과과정이 필요하다.

1) 칼럼  크로마토그래프용 칼럼은 단백질 특성에 따라 적절하게 선택한다. 예를 들면 실리카겔로 100 〜 300 Å 공극 크기를 가진 칼럼이 분리에 가장 좋고, 소형 펩티드에는 입자경이 3 〜 10 μm인 옥틸실릴화실리카겔칼럼 (C8)과 입자경이 1.7 〜 10 μm인 옥타데실릴화실리카겔칼럼(C18)이 입자경이 5 〜 10 μm인 부틸실릴화실리카겔칼럼 (C4)보다 더 효율적이다.

2) 용매  가장 널리 사용되는 유기용매는 아세토니트릴과 정제수 혼합액에 0.1 % 이하의 트리플루오로아세트산이 첨가된 용매이다. 단백질 분해물의 점도를 크게 증가시키지 않는다면 용해도를 높이기 위해 필요시 이소프로판올 또는 n-프로판올을 첨가할 수 있다.

3) 이동상  인산염을 포함하는 이동상은  pH 조건을 선택하는데 있어서 유연성을 제공한다. pH 3.0 〜 5.0 범위에서의 변화는 글루타민산과 아스파라긴산 등의 산기를 포함한 펩티드의 분리능을 증진시킬 수 있다. pH 2 〜 7 (중합체 기반 충진제의 경우 더 높은 pH) 사이의 인산나트륨과 인산칼륨, 아세트산암모늄, 인산 등은 아세토니트릴을 이용한 용매기울기 분리 조건에서 함께 사용되며, 트리플루오로아세트산이 함유된 아세트니트릴이 자주 사용되고 있다.

4) 용매기울기에 의한 분리  용매기울기에는 선형, 비선형 등이 포함된다. 복잡한 혼합물을 분리하기 위해서는 기울기가 완만한 것이 좋다. 기울기는 시료의 지표 피크가 될 1 개 또는 2 개의 피크가 명확히 분리되도록 최적화되어야 한다.

5) 단일용매에 의한 분리  한 개의 이동상을 사용하는 액체크로마토그래프법은 사용이 편리하고 검출 감도가 높다. 그러나 때로는 각 피크를 명확히 분리하기 위한 이동상의 최적 조성을 얻기가 어렵다. 이동상의 조성비 또는 pH의 작은 변화에도 펩티드 피크의 머무름시간에 심각한 영향을 준다면 단일용매법을 사용하지 말아야 한다.

6) 기타 인자들  칼럼의 온도 조절은 좋은 재현성을 위하여 반드시 필요하다. 이동상의 유속은 0.05 〜 2.0 mL/분 정도이며, 200 〜 230 nm에서 자외부 검출기로 펩티드를 검출한다. 그 밖에 칼럼 후 유도체화 등과 같은 여러 검출 방법들이 있지만 자외선 검출만큼 재현성이 있거나 다목적성을 갖고 있지는 않다.

7) 시스템 적합성  이는 시험방법을 전반적으로 평가하는 것이다. 시스템 적합성의 판정기준은 시험결과물 해석과 판정에 영향을 주는 주요 시험인자들을 규명하는데 달려있으며, 이러한 주요인자들은 펩티드 분해와 분석을 검증하는 기준이 된다. 원하는 분해종말점에 도달되었는지 여부의 지표는 시료 단백질과 동일한 방식으로 처리한 표준품과 비교하면 확인할 수 있다. 따라서 시료 단백질과 병행하여 표준품을 사용하는 것은 시스템 적합성 한도를 만들고 설정하는데 필수적이며, 추가 비교를 위해 표준품의 크로마토그램이 포함되어야 한다. 펩티드 분석을 위한 주요 시스템적합성 인자는 특정 펩티드 분리 및 검출 방식과 자료분석 요건에 달려있다.

펩티드 지도작성법이 확인시험에 사용될 때 확인된 펩티드의 시스템 적합성 판정요건은 선택성과 정밀성이다. 이 경우 변이단백질의 확인시험을 하고자 할 때, 단백질 표준품의 펩티드 지도와 비교하여 펩티드 지도상의 펩티드 조각들의 일차구조를 확인하는 것은 이미 알고 있는 일차구조에 대한 검증과 변이단백질에 대한 정보를 제공한다. 펩티드 분리도를 결정하기 위해 분해된 표준시료를 사용하는 것도 하나의 방법이다. 변이단백질 분석을 위해 변이펩티드가 펩티드 지도상에서 잘 분리되지 않는 지점에 위치한다면 특성화된 변이체 혼합물과 표준품을 사용한다. 펩티드 양상의 일관성 지표는 검출된 주 펩티드 피크의 수를 사용할 수 있다. 펩티드 양상의 일관성은 펩티드 피크들의 분리도로 가장 잘 정의될 수 있다. 피크 간 분리, 최대 피크의 너비, 피크면적, 피크꼬리인자, 칼럼효율성 등의 크로마토그래프법 인자들은 펩티드 분리도를 정의하는데 사용된다. 시험 단백질과 사용되는 분리 방법에 따라 한 개 또는 여러 개 펩티드의 분리 요건이 필요하다.

표준물질 분해물을 반복 분석하여 정밀성과 정량적 회수율을 측정할 수 있다. 확인된 펩티드의 회수율은 일반적으로 펩티드 표준품을 사용하여 평가할 수 있으며, 정밀성은 상대표준편차로 표현한다. 확인된 펩티드의 회수율과 정밀성에 차이가 발생할 것으로 예상되므로, 이에 대한 시스템적합성 기준은 설정되어야 한다. 이러한 기준들은 각 단백질마다 다르므로 의약품 각조에 규정될 것이다.

시스템 적합성을 위한 상대 머무름시간, 피크면적 또는 피크높이와 같은 피크반응, 피크 수 및 전반적 유출 양상 등은 초기 육안 비교로 확인될 수 있고 이는 피크반응 비의 수학적 분석이나 시료 분해물과 표준물질 분해물의 1 : 1(V/V) 혼합물의 크로마토그래프 양상을 통해 보완될 수 있다. 만약 시료 분해물과 표준물질 분해물에 있는 모든 피크들이 상대적으로 동일한 머무름과 피크 반응 비를 보인다면 시료의 동정은 확인된 것이다.

만약 피크들이 초기에 상당히 다른 상대 머무름 시간에서 유출되었다가 1 : 1 혼합물에서 하나의 피크로 관찰된다면 이는 시스템 변동을 보여주는 것이다. 그러나 1 : 1 혼합물에서 여러 피크들이 관찰된다면 이는 각 피크의 펩티드들이 동일하지 않다는 것을 보여준다. 만약 1 : 1 혼합물에서 피크가 시료 분해물이나 표준물질 분해물의 해당 피크보다 확연히 넓어졌다면 서로 다른 펩티드들이 존재하는 것이다. 펩티드 지도 결과 분석은 컴퓨터에 기반한 소프트웨어가 이용되고 있으며 그 외에도 자동화 방식인 수리공식, 모델 및 양상 인식 등이 사용되고 있는데, 그 예로서 적외부 흡광분석법에 의한 자동확인이나 펩티드 확인을 위한 다이오드어레이 자외가시부 흡광도측정법의 응용 등이 있다. 그러나 이러한 방법들도 부적절한 분리, 펩티드 조각의 동시 유출, 또는 시료 분해물과 표준물질 분해물 사이의 절대 피크반응의 차이라는 한계를 갖고 있다.

머무름시간, 피크면적 또는 피크높이들의 산술적 비교는 선택된 해당 피크들 그룹의 펩티드 지도의 정확한 확인을 위해 사용될 수 있다. 피크면적은 변화가 가장 작은 하나의 피크를 내부표준물질로 하여 산출할 수 있는데, 피크면적의 적분은 기준선 변화에 쉽게 영향을 받기 때문에 분석오류가 생길 수 있다는 것을 고려해야 한다. 그렇지 않으면 시료에 대해 모든 피크높이들의 합에 대한 각 펩티드 피크높이의 백분율로 산출할 수도 있는데, 이 백분율은 표준물질의 해당 피크의 백분율과 비교한다. 트립신 절단제의 자가분해 가능성 확인은 공시험액을 트립신 처리하여 얻은 펩티드 지도 결과로 알 수 있다.

펩티드 지도작성법의 적격성에 대한 최소 요건은 대조시험으로서 시스템 적합성을 포함하는 승인된 시험법을 따르는 것이다. 일반적으로 초기 규제과정에서는 단백질의 펩티드 지도작성법의 적격성을 평가하는 것으로도 충분하다. 그러나 허가승인과정이 진행되면, 적격성 평가에 추가적으로, 단백질에 대한 펩티드 지도작성법 개발이 의도된 대로 실행되는지를 보증해 줄 수 있는 부분 밸리데이션이 포함되어야 한다.

펩티드 조각의 확인  펩티드 지도작성  법을 정성분석으로 사용할 때에는 각 펩티드 피크들의 완전한 규명이 필요하지 않다. 그러나 허가심사시 요구되는 시험법 검증을 위해서는 펩티드 개별 피크들에 대한 정확한 특성분석이 필요하다. 펩티드 피크의 특성분석법에는 N-말단 서열분석법, 질량분석법 등이 있다. 특성분석 목적으로 N-말단 서열분석법을 사용할 때에는 분리 분석 규모를 확대하게 되는데 이 경우 펩티드 피크들의 분리도에 영향을 줄 수 있기 때문에 규모 확대가 분리도에 영향을 주지 않았음을 입증해야 한다.  N-말단 서열분석을 위한 시료는 각 펩티드 피크의 유출액을 모아서 진공농축을 하여 제조하는데, 필요하다면 이를 다시 크로마토그래프법으로 분리하기도 한다. N-말단 서열분석에서 펩티드 조각의 아미노산 분석은 보통 펩티드 크기에 의해 제한을 받는다. 다른 한편 만일 N-말단이 차단되어 있다면 서열분석 전에 이를 제거하여야 한다.  카르복시펩티다제와 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형(MALDI-TOF) 질량분석기가 조합된 펩티드의 C-말단 서열분석법도 단백질 특성분석에 사용될 수 있다. 질량분석기를 사용한 펩티드 조각의 특성분석에서 분리된 펩티드 시료는 직접 또는 크로마토그래피 장치와 기계적으로 연계되어 구조분석용 질량분석기로 주입된다. 탠덤 질량분석법 (Tandem MS)은 변이단백질의 서열을 분석하여 아미노산 변이 형태를 알아내는데 사용된다. 또한 환원 전후의 분해물 질량스펙트럼을 비교해보면 여러 펩티드에 있는 디설피드결합의 위치를 확인할 수 있다.

만약 사용한 펩티드 지도분석으로 단백질 일차구조의 특정 영역을 알아낼 수 없다면 이차 펩티드 지도를 만들 필요가 있다. 펩티드 지도작성을 통한 단백질 특성분석의 목표는 단백질 일차구조의 95 % 이상을 규명하는 것이다.

<신  설>

70. 폴리아크릴아미드겔 전기영동법

폴리아크릴아미드겔 전기영동법 (PAGE)은 생물학적제제 내 단백질의 정성적 분석이나 단백질 순도를 위한 정량적 분석에 사용된다. 전기영동 분석은 의약품 내 단백질의 동질성을 확인하고 평가하는데 적합한 방법이다. 이 방법은 정제된 단백질의 분자량을 측정하거나 혼합되어 있는 단백질의 조성을 결정하는데 널리 사용된다. 곧바로 사용할 수 있는 겔과 시약들이 널리 판매되고 있으며, 시험의 유효성 요건을 충족하고 동일한 결과를 얻을 수 있다면, 여기에서 언급된 것들을 대체하여 사용할 수 있다.

전기영동법은 전기장 하에서 전하를 가진 물질이 반대 전하를 갖고 있는 전극으로 이동하는 원리를 이용한다. 겔 전기영동법에서 입자는 분자여과 작용을 하는 겔 매트릭스와의 상호작용에 의하여 이동이 저지된다. 전기력에 의한 분자여과라는 대립 작용에 의해 입자의 크기, 모양 및 전하의 종류에 따라, 겔에서의 이동 속도는 달라진다. 이러한 물리화학적 특성들의 차이로 인해 혼합물 내 거대분자들이 전기영동시 다른 속도로 이동하여 분리된다.

폴리아크릴아미드겔의 특성들

폴리아크릴아미드겔의 여과 특성은 양기능성 비스아크릴아미드가 폴리아크릴아미드 사슬과 교차결합할 때, 삼차원적 섬유망이 형성되면서 공극이 만들어진다. 이러한 중합현상은 과황산암모늄과 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (테메드)에 의해 촉매된다.

겔의 아크릴아미드 농도가 증가하면 형성된 겔의 공극 크기는 감소한다. 겔의 공극 크기는 겔의 여과특성을 변화시켜 겔에서의 단백질의 이동성을 결정한다. 겔의 농도가 높으면 겔이 쉽게 부서져서 다루기 힘들고, 공극 크기가 작아져 단백질이 겔을 통해 이동하는 속도가 느려지기 때문에, 사용할 수 있는 아크릴아미드의 농도에는 한계가 있다. 따라서 분석하고자 하는 단백질에 대한 분리가 최적화 될 수 있도록 적절한 아크릴아미드 농도 조절을 통해 겔의 공극 크기를 결정하며, 아크릴아미드와 비스아크릴아미드 각각의 조성 변화가 이러한 사용되는 겔의 물리적 특성을 반영한다.

겔의 조성과 더불어 단백질의 상태도 전기영동에서 단백질 이동에 중요한 요소이다. 단백질의 전기영동 상에서의 이동은 전하를 띤 기들의 해리상수 (pK)값과 분자크기에 따라 결정된다. 또한 완충액의 종류, 농도, pH, 온도, 전기장의 세기, 지지체의 특성에 의해서도 영향을 받는다.

변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동

이 방법은 분자량이 14000 〜 100000의 범위의 단백질 분석에서 주로 사용되지만, 농도기울기 겔이나 특정 완충액 시스템 등 다양한 기법을 이용하면 분자량 범위를 넓힐 수 있다.

변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동법은 단백질을 겔에 주입하기 전, 단백질 응집을 최소화하기 위해 강한 음이온 계면활성제 (Detergent)인 도데실황산나트륨과 함께 가열하는 방법으로 단백질의약품의 품질평가에 가장 흔히 사용되는 전기영동 방법이다.

이렇게 변성된 단백질들은 도데실황산나트륨과 결합하여 음전하를 띠게 되며 단백질 형태와 관계없이 일정한 전하 대 질량비를 나타낸다. 단백질과 결합하는 도데실황산나트륨 양은 분자량에 비례하며 아미노산 서열과는 무관하기 때문에, 도데실황산나트륨-단백질 복합체는 폴리아크릴아미드겔 상에서 단백질의 크기에 따라 이동하게 된다.

전기영동에서 도데실황산나트륨-단백질 복합체는 분자량에 대해 반비례하여 이동하는 것으로 가정한다. 따라서 도데실황산나트륨-단백질 복합체 중 작은 것은 큰 것보다 빠르게 음극으로 이동한다. 이에 따라 보정용 폴리아크릴아미드겔에서의 상대적 이동 거리로부터 각 단백질 분자량의 측정이 가능하며, 분리된 각 단백질 밴드로 순도를 측정할 수 있다.

그러나 단백질에 N- 또는 O-당화가 된 경우, 단백질 분자량 측정에 중대한 영향을 미치게 된다. 왜냐하면 당단백질의 당질화 부위에는 일정한 전하 대 질량비로 도데실황산나트륨이 붙지 않기 때문이다. 따라서 번역 후 (post-translational) 변형된 (modified) 단백질의 분자량은 반드시 폴리펩티드 사슬의 분자량과 일치하지는 않는다.

환원 조건

단백질은 디설피드결합에 의해 그 형태가 유지되기도 한다. 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 (DTT) 환원제로 처리하면 단백질의 삼차구조가 풀리면서 도데실황산나트륨과 결합하게 된다. 이러한 조건하에서 단백질들의 분자량은 적절한 분자량 표준품의 존재 하에서 선형회귀분석을 적용하여 산출할 수 있다.

비환원 조건

경우에 따라 단백질을 환원조건으로 분석하는 것이 바람직하지 않을 때도 있다. 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 같은 환원제로 처리하지 않으면, 디설피드결합이 그대로 보존되어 단백질의 삼차구조가 유지된다. 더욱이 비환원 단백질은 도데실황산나트륨으로 완전히 포화되지 않기 때문에, 일정한 질량비로 도데실황산나트륨이 결합하지 않는다.

분자량 표준품과 검체가 유효 분석을 위한 유사 구조를 갖고 있어야하기 때문에, 환원 조건으로 분석하는 것보다 단백질 분자량이 덜 정확할 수 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 조건의 겔에서 분리된 밴드를 통해 분석하고자 하는 단백질의 순도를 측정할 수 있다.

불연속완충액시스템의 전기영동

두 개의 인접한 서로 다른 겔, 즉 위쪽 압축겔과 아래쪽 분리겔로 이루어진 불연속완충시스템의 전기영동법이 단백질 혼합물의 분석에서 가장 많이 사용한다. 두 개의 겔은 서로 다른 공극 크기, pH, 이온강도로 이루어진다. 또한 두 겔과 전기영동 완충액에 다른 이동성 이온들이 사용된다. 이러한 완충액의 불연속성은 많은 용량의 검체를 압축겔에 농축하여 분리도를 높여준다. 전기를 흘려주면 검체 사이로 전압강하가 형성되면서 단백질이 압축겔로 이동하고 그 뒤를 따라 전기영동 완충액의 글리신염이 압축겔로 이동한다. 앞쪽에 빠르게 이동하는 염화이온과 뒤쪽에 비교적 느리게 이동하는 글리신염 이온으로 만들어진 이동 경계지역이 형성된다. 이렇게 앞과 뒤에 위치한 이온들 사이에 형성된 높은  전압 차의 이동 경계지역을 단백질이 이동하게 된다. 이로 인해 검체의 주입량에 상관없이 모든 단백질은 좁은 영역에 농축되어 분리겔로 들어가게 된다. 공극이 큰 압축겔은 대부분 단백질의 이동을 방해하지 않으며 단백질이 퍼지는 것을 막아주는 역할을 한다. 압축겔과 분리겔 사이의 경계면에서 단백질은 분리 겔의 제한적 공극 크기 때문에 이동 방해를 받게 된다. 그리고 분리겔에 들어오면 단백질의 이동은 겔 매체의 상대적으로 작은 공극 크기에 의해 더욱 느려지게 된다. 그러나 글리신염 이온은 트리스히드록시메틸아미노메탄과 글리신염에 의해 형성된 균일한 pH 영역에서 이동하여 단백질보다 빠르게 이동하게 된다. 분리겔은 단백질이 분자량에 따라 분리될 수 있게 해준다.

불연속수직완충 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 제조

겔 농축 용액

30 % 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액  아크릴아미드 290 g과 메틸렌비스아크릴아미드 10 g을 온수 1 L에 녹인 용액을 만들어 여과한다.  [아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드는 저장하는 동안 각각 아크릴산과 비스아크릴산으로 변하는데, 이러한 탈아민반응은 빛과 알칼리에 의하여  촉매된다. 따라서 이 용액의 pH는 7.0 또는 그 이하이어야 하며, 차광한 용기에 넣어 냉장 보관한다. 장기간 보관하지 않는다.]

과황산암모늄 용액  물 1 L 당 100 g의 과황산암모늄 용액을 소량 만들어 4 ℃에서 보관한다. [과황산암모늄은 아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드를 중합시키는 유리기를 제공하며, 빨리 분해되기 때문에 장기간 보관하지 않는다.]

테메드(N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민) (TEMED) 전기영동에 적합한 것을 사용한다. [테메드는 과황산암모늄으로부터 유리기가 형성되는 것을 촉매하면서 아크릴아미드와 메틸렌비스아크릴아미드의 중합을 촉진시킨다. 테메드는 유리염기로만 작용하기 때문에 낮은 pH에서는 중합반응이 저해된다.]

도데실황산나트륨 용액  물 1 L당 100 g의 도데실황산나트륨 (전기영동법에 적합) 용액을 만들어서 실온에 보관한다.

1.5 mol/L 트리스완충액  트리스히드록시메틸아미노메탄 약 90.8 g을 500 mL 플라스크에 넣어 물 400 mL에 녹이고, 염산으로 pH 8.8로 맞춘 후 물을 첨가하여 희석한다.

1 mol/L 트리스완충액  트리스히드록시메틸아미노메탄 약 60.6 g을 500 mL 플라스크에 넣고 400 mL 물에 녹이고, 염산으로 pH 6.8로 맞춘 후 물을 첨가하여 희석한다.

겔판 준비

두 개의 유리판 (예, 10 cm x 8 cm), 콤 (Comb), 두 개의 간격판, 주형틀을 부드러운 세제로 닦고, 물로 깨끗이 세척한 후, 종이타월 또는 티슈로 닦아서 말린다.

두 개의 간격판을 두 개의 유리판 사이의 짧은 면을 따라 끼운다. 유리판과 간격판을 손으로 누르면서 조임쇠를 각각 끼워 고정한다. 겔을 부어 넣을 준비가 되도록 조임쇠가 없는 긴 면을 겔 주형틀의 밑부분에 고정하여 겔 주형을 만든다.

겔 준비

불연속완충 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔에서는 분리겔과 압축겔의 아크릴아미드-비스아크릴아미드의 조성, 완충액, pH가 다르기 때문에, 분리겔을 먼저 부어 굳히고 압축겔을 부어야 한다.

분리겔 (Resolving Gel)

삼각플라스크에 표 1과 같이 원하는 농도의 아크릴아미드 용액을 필요한 양만큼 준비한다. 주어진 순서대로 성분들을 섞되, 필요시 과황산암모늄 용액과 테메드 용액을 첨가하기 전에 용액에 기포가 생기지 않을 때까지 진공을 걸어준다. 표 1과 같이 과황산암모늄 용액과 테메드 적당량을 첨가하여 흔들고, 준비된 겔판 사이 공간에 즉시 붓는다. 이 때 콤 이빨 길이 1 cm 정도를 포함하여, 압축겔을 위한 충분한 공간을 남겨둔다. 이 후, 수분으로 포화시킨 이소부탄올을 분리겔 용액위에 조심스럽게 부어주고, 겔이 실온에서 중합되도록 한다. 약 30 분 후 중합이 끝나면 이소부탄올을 버리고 분리겔 위쪽을 물로 여러 번 씻어서 이소부탄올과 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거한다. 세척 후, 종이타월로 분리겔에 남아있는 용액을 제거한다.

압축겔 (Stacking Gel)

삼각플라스크에 표 2와 같이 원하는 농도의 아크릴아미드 용액을 필요량만큼 준비한다. 필요시 과황산암모늄 용액과 테메드 용액을 첨가하기 전에 용액에 기포가 생기지 않을 때까지 진공을 걸어준다. 표 2와 같이 과황산암모늄 용액과 테메드를 적정량 첨가한 후 즉시 분리겔 위에 붓고, 깨끗한 콤을 압축겔 용액에 기포가 생기지 않도록 조심해서 끼운다. 끼운 콤의 빈 공간을 압축겔 용액으로 완전히 메운다. 겔을 실온에서 중합하도록 한다.

전기영동 분리

검체완충액 1 - 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 염산으로 pH를 6.8로 조정하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다. 검체완충액 1은 사용하기 직전에 검체와 같은 양으로 일대 일로 섞어 사용한다.

검체완충액 2 (환원 조건) - 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 환원시약인 2-메르캅토에탄올 12.5 mL을 첨가한다. 염산으로 pH를 6.8로 조정하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다. 2-메르캅토에탄올 대신에 다른 환원시약인 디티오트레이톨을 사용해야 할 경우에는 트리스히드록시메틸아미노메탄 1.89 g, 도데실황산나트륨 5.0 g, 브로모페놀블루 50 mg, 글리세린 25.0 mL를 물 100 mL에 녹인다. 최종적으로 디티오트레이톨 농도가 100 mmol/L이 되도록 미리 첨가하고, 추가로 물을 첨가해 최종 부피가 125 mL이 되도록 만든 다음 잘 섞어서 보관한다.

전기영동 완충액 - 트리스히드록시메틸아미노메탄 151.4 g, 글리신 721.0 g, 도데실황산나트륨 50.0 g을 물에 충분히 녹인 후 물을 더해 5 L로 만들어서 전기영동 완충액 10 배 원액을 만든다. 사용하기 직전 이 원액을 물로 10 배 희석하고 pH를 8.1 ∼ 8.8로 맞춘다.

실험방법

압축겔이 중합이 끝나 충분히 굳으면, 압축겔에 검체가 들어갈 틈을 만들기 위해 넣었던 콤을 조심스럽게 제거한다. 생성된 틈은 즉시 물이나 전기영동 완충액으로 세척하여 남아있을 수 있는 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거한다. 필요시 주사바늘로 그 틈을 정돈해 준다. 겔판을 전기영동 장치에 조심스럽게 장착한다.

표 1. 분리겔 준비
	조성 용량 (mL) / 겔용량
용액 조성	5 mL	10 mL	15 mL	20 mL	25 mL	30 mL	40 mL	50 mL
6 % 폴리아크릴아미드겔
물	2.6	5.3	7.9	10.6	13.2	15.9	21.2	26.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	8.0	10.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	7.5	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.3	0.4	0.5
테메드	0.004	0.008	0.012	0.016	0.02	0.024	0.032	0.04
8 % 아크릴아미드
물	2.3	4.6	6.9	9.3	11.5	13.9	18.5	23.2
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.3	2.7	4.0	5.3	6.7	8.0	10.7	13.3
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.003	0.006	0.006	0.012	0.015	0.018	0.024	0.03
10 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.9	4.0	5.9	7.9	9.9	11.9	15.9	19.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	1.7	3.3	5.0	6.7	8.3	10.0	13.3	16.7
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
12 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.6	3.3	4.9	6.6	8.2	9.9	13.2	16.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	16.0	20.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2.5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
14 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.4	2.7	3.9	5.3	6.0	8.0	10.6	13.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.3	4.6	7.0	9.3	11.6	13.9	18.6	23.2
1.5 mol/L 트리스완충액	1.2	2.5	3.6	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02
15 % 폴리아크릴아미드겔
물	1.1	2.3	3.4	4.6	5.7	6.9	9.2	11.5
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	2.5	5.0	7.5	10.0	12.5	15.0	20.0	25.0
1.5 mol/L 트리스완충액	1.3	2..5	3.8	5.0	6.3	6.3	10.0	12.5
도데실황산나트륨 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
과황산암모늄 용액	0.05	0.1	0.15	0.2	0.25	0.25	0.4	0.5
테메드	0.002	0.004	0.006	0.008	0.01	0.012	0.016	0.02

표 2. 압축겔 준비
	조성 용량 (mL) / 겔용량
용액 조성	1 mL	2 mL	3 mL	4 mL	5 mL	6 mL	8 mL	10 mL
물	0.68	1.4	2.1	2.7	3.4	4.1	5.5	6.8
30 % 아크릴아미드 - 비스아크릴아미드 용액	0.17	0.33	0.5	0.67	0.83	1.0	1.3	1.7
1 mol/L 트리스완충액	0.13	0.25	0.38	0.5	0.63	0.75	1.0	1.25
도데실황산나트륨 용액	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06	0.08	0.1
과황산암모늄 용액	0.01	0.02	0.03	0.04	0.05	0.06	0.08	0.1
테메드	0.001	0.002	0.003	0.004	0.005	0.006	0.008	0.01

겔을 전기영동장치에 올려놓고, 전기영동 완충액을 위쪽과 아래쪽 탱크에 채운다. 압축겔의 검체 틈 사이의 기포들은 구부러진 주사바늘로 제거해준다. 압축겔의 완충효과가 없어질 수가 있기 때문에, 압축겔에 검체를 주입하기 전에는 예비 전기이동을 하지 않는다. 검체를 주입하기 전에 압축겔을 전기영동 완충액으로 조심스럽게 씻어준다.

위의 시약제조 부분에 명시된 방법에 따라 만들어진 검체완충액으로 검체를 일대 일로 섞어서 시험액을 만들고 표준품도 같은 방법으로 만든다. 압축겔에 검체와 표준품 적당량을 주입한다. 전기영동 제조사마다 기기 사용방식이 차이가 있으므로, 제조사에서 제시한 방법으로 조건을 맞추어 실험 목적에 맞게 전기영동을 실행한다. 단백질 분리의 최적 조건은 전기영동을 실시할 때 시간과 전압이 제조사에서 제시한 것과 달라질 수도 있다. 전기영동의 실시간 진행사항은 염료의 이동 상태를 통해 알 수 있다. 이 때 염료가 분리겔로 이동을 잘하는지 확인하고, 염료가 겔의 하단에 도달하면 전기영동을 멈춘다. 겔을 전기영동장치로부터 분리하여 압축겔을 잘라 버린 후 단백질 염색작업을 한다.

단백질검출

쿠마시 염색은 가장 많이 사용되는 단백질 염색법으로 밴드 당 1 〜 10 μg 정도까지 단백질 양을 확인할 수 있다. 은염색은 밴드 안의 단백질양이 10 〜 100 ng 정도까지 검출할 수 있는 훨씬 민감한 염색법이다.

모든 염색 단계는 회전 교반기 위에서 천천히 실온에서 교반한다. 염색 시 손이 염색될 수 있으므로 장갑을 착용한다.

시약

쿠마시염색액 - 물․메탄올․초고순도아세트산혼합액(5 : 4 : 1)을 섞은 용액 1 L에 1.25 g의 쿠마시브릴리안트블루 R-250을 용해한 다음 여과지로 여과하고 실온에서 보관한다.

탈색액 -  물․메탄올․초고순도아세트산혼합액(5 : 4 : 1)

고정액 I - 물․메탄올․트리클로로아세트산혼합액(5 : 4 : 1)

고정액 II - 메탄올 250 mL을 500 mL 플라스크에 넣고 포름알데히드 0.27 mL를 첨가한 후 물로 희석하여 500 mL로 용량을 맞춘다.

질산은액 - 1 mol/L 수산화나트륨용액 40 mL과 암모니아수 3 mL의 혼합액에 200 g/L의 질산은 용액 8 mL를 교반하면서 한 방울씩 첨가한 후 물을 가하여 200 mL가 되게 만든다.

현상액 - 2 % 시트르산 용액 2.5 mL과 포름알데히드 0.27 mL을 물로 희석하여 500 mL을 만든다.

정지액 - 10 % 아세트산

쿠마시염색

겔을 충분히 담글 수 있을 만큼의 양의 쿠마시 염색액에 넣고 1시간 이상  교반한 후 쿠마시 염색액을 제거한다. 그리고 충분한 양의 탈색액으로 교반기에서 천천히 겔을 탈색시킨다. 염색된 단백질 밴드가 투명한 배경으로부터 분명히 구분되어 보일 때까지 탈색액을 여러 번 바꾸면서 탈색시킨다. 겔이 잘 탈색되면, 검출 감도가 높아져 소량의 단백질 까지 확인할 수 있다. 음이온교환수지나 작은 스펀지를 탈색액에 조금 넣으면, 탈색을 빨리 진행시킬 수 있다. 이 과정에서 사용되는 산-알코올 용액들은 겔 안의 단백질을 완전히 고정하지 않기 때문에, 얇은 겔 상에 있는 저분자 단백질들이 탈색할 때 소실 될 수 있다. 그러나 고정액 I에 1시간 정도 먼저 처리한 다음 겔을 쿠마시염색액에 넣어 염색하면 탈색할 때 저분자 단백질들의 소실을 막을 수 있다.

은염색

겔을 충분히 적실 수 있는 정도의 양의 고정액 II를 준비하여 1시간 정도 천천히 교반한 후, 고정액 II를 제거하고, 새로운 고정액 II를 넣어 1시간 이상 또는 하룻밤 처리한다. 고정액 II를 버리고 겔을 충분한 양의 물로 1시간 동안 교반한다. 겔을 1 % 글루타르알데히드 용액에 15분간 담근 후, 충분한 양의 물로 15분씩 교반하면서 두 번 세척한다. 겔은 질산은액에 15분간 담근 후, 충분한 양의 물로 5분씩 세 번 교반하여 세척한다. 질산은액은 암실에서 실험 할 때마다 새로 만들어야 한다. 겔을 현상액에 약 1분간 현상하여 단백질 밴드가 잘 확인될 정도가 되면, 과하게 현상되는 것을 막기 위해서, 정지액에 겔을 15분간 교반한 다음 정지액을 버리고 물로 다시 교반한다.

겔건조

겔은 염색방식에 따라 다른 건조방법을 사용한다. 쿠마시 염색을 한 경우 탈색 후 겔을 100 g/L 글리세린 용액에 2 시간 이상 처리하고, 은염색을 한 경우는 100 g/L  글리세린 용액에 2 시간 이상 처리한 이후, 20 g/L 글리세린 용액에 5분간 처리하는 세척과정을 추가한다.

두 장의 다공성 셀룰로오스 필름을 물에 5 〜 10분간 담근 후, 이 중 한 장을 건조대에 올려놓고 조심스럽게 겔을 들어 셀룰로오스 필름 위에 올려놓는다. 포집된 기포를 제거한 후 겔 바깥쪽 주변에 적당한 양의 물을 부어 기포가 생기지 않도록 막는다. 두 번째 셀룰로오스 필름을 올려놓고 포집된 기포를 제거한다. 건조 틀 조립을 마치면 건조될 때까지 실온에 둔다.

분자량 결정

단백질의 분자량은 이미 알려진 분자량을 가진 지표 단백질들의 이동거리와 비교해서 결정한다. 사용되는 지표 단백질들은 분자량을 정확히 알고 있는 단백질 혼합물이어야 하고 염색이 균일하게 되어야 한다. 다양한 범위의 분자량 지표 단백질들을 포함하고 있는 지표단백질 농축 원액을 적절한 검체완충액에 희석하고 시험  검체와 함께 같은 겔에 부하한다.

염색 후 단백질 밴드 (지표 또는 검체 단백질)의 분리겔 위로부터의 이동 거리를 재서, 브로모페놀블루 염료의 위치를 확인하여 염료의 브로모페놀블루 이동 거리로 나눈다. 이렇게 얻어진 표준화된 이동거리를 브로모페놀블루 염료에 대한 상대적인 단백질의 상대이동도라고 하며, Rf 수치라고 부른다. Rf 수치 대비 지표 단백질의 분자량 (MR)의 로그 그래프를 만드는데, 약간 S자형이 될 수도 있다. 미지의 단백질 수치가 그래프 상의 직선상에 위치한다면 Rf에 대한 log MR 커브로부터 선형 외삽 회귀분석법으로 미지의 분자량을 측정할 수 있다.

유효성 검증

분자량 지표 단백질들 중 가장 작은 크기의 단백질이 겔 전체 길이의 80 % 이내로 전개되거나, 의약품 단백질과 의약품 단백질의 이량체 또는 의약품 단백질에서 유래한 유연불순물들이 서로 분리되지 않았다면 그 시험은 유효하지 않다.

각 단백질의 상대이동도 Rf와 로그 분자량 사이에 선형 관계를 이루면서 각 단백질 간의 분리가 나타난다. 추가적인 검증 요구사항들은 각 의약품 각조에 명시되어 있다.

불순물의 정량

의약품각조에 불순물 단백질 한도가 규정되어 있는 경우, 해당 검체액을 희석하여 불순물 단백질 한도 측정용 표준액을 만들어야 한다. 예를 들어 불순물 단백질 함량이 의약품 단백질 함량의 5 %가 기준이라면, 의약품 단백질 검체액을 희석액으로 1 : 19 비율로 희석하여, 5 % 함량 기준의 불순물 단백질 한도 측정용 표준액을 만들어서 사용해야 한다. 전기영동 결과, 검체액에서 주 밴드 이외에는 어떤 불순물 밴드도 5 % 함량 표준액에서 얻어진 밴드보다 더 커서는 안 된다. 검증된 조건하에서 밀도측정기를 사용, 주 밴드의 밀도값을 기준으로 불순물의 밀도값을 상대화함으로서 불순물의 양을 측정할 수 있다.

67. 플라스틱제의약품용기시험법

(생  략)

71. 플라스틱제의약품용기시험법

(현행과 같음)

68. pH 측정법

(생  략)

72. pH 측정법

(현행과 같음)

69. 항생물질의 미생물학적 역가시험법

(생  략)

73. 항생물질의 미생물학적 역가시험법

(현행과 같음)

70. 핵자기공명스펙트럼측정법

(생  략)

74. 핵자기공명스펙트럼측정법

(현행과 같음)

71. 형광광도법

(생  략)

75. 형광광도법

(현행과 같음)

72. 황산염시험법

(생  략)

76. 황산염시험법

(현행과 같음)

73. 황산에 의한 정색물시험법

(생  략)

77. 황산에 의한 정색물시험법

(현행과 같음)

74. 히스타민시험법

(생  략)

78. 히스타민시험법

(현행과 같음)

75. 표준품, 시약․시액, 용량분석표준액, 표준액, 색의 비교액, 파장 및 투과율보정용광학필터, 계량기·용기, 멸균법 및 무균조작법

1) 표준품 (전단생략)

메틸페니데이트염산염에리스로이성체

텔미사르탄유연물질 II {4’-[(1,7’-디메틸-2’프로필l-1H,1’H-2,5’-비벤조[d]이미다졸-1’-일)메틸]비페닐-2-카르본산}

2) 시약·시액

키니노겐 (전단생략)

이 약 1 mg의 키닌 유리능

(μg 브라디키닌 등량/mg) = BK × 0.0096

79. 표준품, 시약․시액, 용량분석표준액, 표준액, 색의 비교액, 파장 및 투과율보정용광학필터, 계량기·용기, 멸균법 및 무균조작법

1) 표준품 (현행과 같음)

메틸페니데이트유연물질 A ((RS.SR)2-phenyl-2-(piperidin-2-yl) acetic acid) 표준품

텔미사르탄유연물질 I {1,7′-디메틸-2′-프로필-1H,3′H-2,5′-비벤조[d]이미다졸}, 텔미사르탄유연물질 II {4′-[(1,7′-디메틸-2′-프로필-1H,1′H-2,5′-비벤조[d]이미다졸-1′-일)메틸]비페닐-2-카르복실산}

2) 시약·시액

키니노겐 (현행과 같음)

이 약 1 mg의 키닌 유리능

(μg 브라디키닌 등량/mg) = BK × 0.96